曹雪平，王兆芬&，王玉清，李 斌，李詠雪，王 玲，韓曉茹

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海省第四人民醫(yī)院，青海 西寧 810001)

全球大約有1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，僅有%～10%的人發(fā)病，顯示感染具有明顯的個(gè)體差異性，即遺傳因素在結(jié)核發(fā)病過程中可能起著重要作用[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，鼠類Nramp1基因?qū)κ箢惤Y(jié)核病的易感有一定作用，而鼠Nramp1基因與人的NRAMP1基因有88%的同源性，因此，有研究推測(cè)它們可能有相同的功能[3]。為了探究NRAMP1基因多態(tài)性與青海地區(qū)人群結(jié)核病易感的相關(guān)性，本研究選取3′UTR、D543N、INT4三個(gè)位點(diǎn)研究NRAMP1基因?qū)Y(jié)核病的影響，為青海地區(qū)人群結(jié)核病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象

本研究選取青海省第四人民醫(yī)院273例肺結(jié)核患者、289例非結(jié)核患者作為結(jié)核組、對(duì)照組，兩組間研究對(duì)象一般情況均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果具有可比性。見表1。

表1 研究對(duì)象一般情況[n(%)]Table 1 General information of research objects[n(%)]

續(xù)表

經(jīng)卡方檢驗(yàn)顯示，NRAMPI 基因3′UTR、D543N和INT4位點(diǎn)基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，各基因型在結(jié)核組和對(duì)照組中的分布是均勻的，所選擇的人群具有群體代表性。

研究方案經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試劑

儀器：凝膠成像分析儀、Mini PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品；凝膠成像分析儀、NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-12)為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

試劑：DNA提取試劑盒、Taq PCR MasterMix(2×，批號(hào)：KT211)、GeneGreen核酸染料(批號(hào)：RT210)和雙蒸水(ddH2O，批號(hào)：R7015)為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；FokⅠ內(nèi)切酶、AvaⅡ內(nèi)切酶、ApaⅠ內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品；瓊脂糖(西班牙原裝，批號(hào)：192255)為上海貝晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計(jì)方案

采用病例-對(duì)照研究，收集世居青海地區(qū)的273例肺結(jié)核患者為結(jié)核組，另選同期289名與結(jié)核組相匹配的非結(jié)核患者為對(duì)照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增3′UTR、D543N、INT4位點(diǎn)基因并測(cè)定基因型，分析青海地區(qū)結(jié)核病易感性與NRAMP1基因多態(tài)性的相關(guān)性。

1.2.2 試驗(yàn)方案

1.2.2.1 血樣采集

采集外周靜脈血約2 mL，用2% EDTA抗凝，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2.2 DNA提取

采用DNA提取試劑盒抽提300 μL全血中的基因組DNA進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)。

1.2.2.3 引物設(shè)計(jì)

利用NCBI的primer blast引物設(shè)計(jì)功能設(shè)計(jì)引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3′UTR及D543N的引物序列：上游引物為5′-GCATCTCCCCAATTCATGGT-3′，下游引物為5′-AACTGTCCCACTCTATCCTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為244 bp。

INT4的引物序列：上游引物為5′-CTGCCTCCTCACAGCTTCTCT-3′，下游引物為5′-CTGCCTCCTCACAGCTTCTCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為400 bp。

1.2.2.4 目的基因擴(kuò)增

采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：NRAMP1基因的PCR反應(yīng)體系總體積為30 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，無菌雙蒸水18 μL。3′UTR及D543N序列反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性600 s；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸300 s。INT4序列反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性600 s；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 300 s。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳(用 1.8% 的瓊脂糖凝膠)檢測(cè)，通過凝膠成像分析儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.2.5 基因測(cè)序

PCR產(chǎn)物由生工生物工程上海(股份)有限公司純化并測(cè)序，通過Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2.6 酶切

使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)進(jìn)行酶切。對(duì)測(cè)序不合格的樣本重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行酶切。反應(yīng)總體積均為20 μL，按3′UTR、D543N、INT4順序進(jìn)行酶切：擴(kuò)增產(chǎn)物為6、6、7 μL；10×M Buffer、0.1%BSA 各2 μL、10×AvaⅡ Buffer 2 μL、10×L Buffer各2 μL；FokⅠ1 μL、AvaⅡ1 μL、ApaⅡ各1 μL；無菌雙蒸水為9、11、10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 1 h、30 ℃ 1 h、37 ℃ 1 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳(用 1.8% 的瓊脂糖凝膠)檢測(cè)，圖像經(jīng)凝膠成像分析儀觀察并記錄。

1.2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用%表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NRAMP1基因各位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

對(duì)樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，以Marker標(biāo)準(zhǔn)核對(duì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度是否符合測(cè)序條件。以下為產(chǎn)物電泳圖。

圖1 3′UTR、D543N位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of 3′UTR and D543N PCR products

圖2 INT4位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of INT4 PCR products

2.2 NRAMP1基因各位點(diǎn)序列測(cè)序結(jié)果

對(duì)各樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，統(tǒng)計(jì)其基因型。以下為測(cè)序峰圖。

2.3 NRAMP1各位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在結(jié)核組與對(duì)照組的分布

結(jié)果顯示3′UTR位點(diǎn)各基因型頻率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，結(jié)核組中TGTG等位基因頻率明顯降低(P=0.001)；D543N位點(diǎn)各基因型頻率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)，結(jié)核組中G等位基因頻率明顯降低(P=0.024)；INT4位點(diǎn)基因型及基因頻率在兩組間均無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 基因型和等位基因頻率的分布[n(%)]Table 2 Distribution of genotype and allele frequency[n(%)]

2.4 NRAMP1基因多態(tài)性與肺結(jié)核的關(guān)系

結(jié)果顯示3′UTR位點(diǎn)TGTG/TGTG和TGTG/del+del/del基因型頻率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，OR為2.139(1.354～3.440)；D543N位點(diǎn)GG和GA+AA基因型頻率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)，OR為1.939(1.108～3.345)；INT4基因型及等位基因頻率均無組間差異(P>0.05)。見表3。

表3 基因型及等位基因頻率與肺結(jié)核的關(guān)系[n(%)]Table 3 Relationship between genotype and allele frequency with tuberculosis[n(%)]

2.5 不同遺傳模型下NRAMP1基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)系

結(jié)果顯示在不同遺傳模型下，INT4位點(diǎn)與肺結(jié)核無關(guān)。3′UTR與顯性和超顯性患者的結(jié)核病發(fā)生有關(guān)[P=0.001，OR為2.139(1.354～3.440)；P=0.002，OR為0.455(0.268～0.755)]。D543N與顯性和超顯性患者的結(jié)核病發(fā)生有關(guān)[P=0.020，OR為1.939(1.108～3.345)；P=0.002，OR為0.515(0.299～0.902)]。見表4。

表4 NRAMP1基因模型與肺結(jié)核的關(guān)系[n(%)]Table 4 Relationship between NRAMP1 gene model and tuberculosis[n(%)]

3 討論

結(jié)核病發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，在影響宿主防御機(jī)制的遺傳學(xué)因素中，NRAMP1基因占有重要地位[4]。NRAMP1基因的編碼產(chǎn)物是分子量約為60kD的疏水蛋白，位于靜止期巨噬細(xì)胞晚期胞腔內(nèi)，在巨噬細(xì)胞吞噬病原體后轉(zhuǎn)移到吞噬體膜，這表明NRAMP1產(chǎn)物可能通過改變吞噬溶酶體內(nèi)環(huán)境限制胞內(nèi)病原體的繁殖[5-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)3′UTR在結(jié)核組中的TGTG/TGTG基因型頻率明顯低于對(duì)照組，TGTG/del+del/del基因型攜帶者患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)為野生純合型TGTG/TGTG人群的2.139倍。D543N在結(jié)核組中GG基因型頻率更低，GA基因型攜帶者結(jié)核病的患病風(fēng)險(xiǎn)為野生純合型GG的1.94倍。青海地區(qū)3′UTR及D543N位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)核病的關(guān)系與國(guó)內(nèi)外許多研究一致。段鴻飛[8]等研究發(fā)現(xiàn)人群3′UTR 缺失型等位基因頻率明顯高于白種人；Ben[9]等研究發(fā)現(xiàn)3′UTR del/del位點(diǎn)可增大患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)，且D543N AA、AG基因型與結(jié)核病易感性有關(guān)；Liu[10]等通過meta分析發(fā)現(xiàn)3′UTR基因多態(tài)性與亞洲人群中結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)；Medapati[11]等通過病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)3′UTR基因多態(tài)性與非洲結(jié)核病易感性相關(guān)；Fernández[12]等研究發(fā)現(xiàn)3′UTR基因多態(tài)性與委內(nèi)瑞拉結(jié)核病易感性有關(guān)。

TGTG/TGTG基因型 TGTG/del基因型 del/del基因型圖3 3′UTR位點(diǎn)測(cè)序峰圖Figure 3 Sequencing peak of 3′UTR

GG基因型 GA基因型圖4 D543N位點(diǎn)測(cè)序峰圖Figure 4 Sequencing peak of D543N

GG基因型 GC基因型 CC基因型圖5 INT4位點(diǎn)測(cè)序峰圖Figure 5 Sequencing peak of INT4

本研究還發(fā)現(xiàn)INT4多態(tài)性與青海地區(qū)人群的結(jié)核病易感性無關(guān)。關(guān)于該位點(diǎn)基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)系，已有許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了研究，結(jié)果不盡一致。Yuan[13]等發(fā)現(xiàn)INT4 C/G基因多態(tài)性與結(jié)核病高度相關(guān)；而Li[14]等研究發(fā)現(xiàn)在西方國(guó)家中INT4多態(tài)性與結(jié)核病易感性無關(guān)；Wu[15]等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病易感性與3′UTR基因多態(tài)性相關(guān)，而與D543N、INT4無關(guān)。

綜上所述，本研究通過對(duì)青海地區(qū)結(jié)核病易感性與NRAMP1基因多態(tài)性的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：(1)NRAMP1基因3′UTR、D543N位點(diǎn)多態(tài)性可能與青海地區(qū)人群肺結(jié)核有關(guān)；(2)NRAMP1基因3′UTR del及D543N A等位基因可能與青海地區(qū)結(jié)核病易感性有關(guān)；(3)INT4位點(diǎn)多態(tài)性與青海地區(qū)人群結(jié)核病的易感性無關(guān)。結(jié)果提示青海地區(qū)結(jié)核病易感性與NRAMP1基因多態(tài)性相關(guān)。