賈亞男 周林 趙陽 汪京 陳晴 王若麟 郎韌 賀強 李先亮

耐受性樹突狀細胞（tolerogenic dendritic cell，tolDC）因其強大的負向免疫調(diào)節(jié)特性，是誘導免疫耐受最有潛力的工具細胞[1-2]。多項研究提示，回輸細胞因子等誘導的tolDC可以延長移植肝、腎的存活時間，但是并未達到耐受的理想狀態(tài)[3-4]，提示研究tolDC在免疫耐受中的作用機制具有重要的臨床意義。

目前認為，具有誘導免疫耐受特性的tolDC主要包括低表達共刺激分子與主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC） Ⅱ 分 子的髓樣樹突狀細胞（myeloid dendritic cell，mDC）和漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）兩類[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)pDC在移植免疫耐受中發(fā)揮著重要作用[6]，然而在免疫耐受誘導中是否同時存在mDC、pDC的變化，二者是否具有協(xié)同作用，至今尚不清楚。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，在耐受與急性排斥反應（acute rejection，AR）模型、tolDC回輸?shù)腁R模型中探明二者的免疫調(diào)節(jié)特性，為誘導免疫耐受提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級Brown Norway（BN）大鼠36只與Lewis大鼠18只（包括建立移植模型及細胞提?。?，體質(zhì)量200～230 g，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證：SCXK-（京）2016-0006。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學倫理委員會批準，實驗過程中對大鼠的處置按照中華人民共和國科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定進行，符合實驗動物倫理學管理要求。

1.2 實驗試劑

重組大鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（20 ng/μL），重組大鼠白細胞介素 4（recombinant rat interleukin-4，rrIL-4）（10 ng/μL），抗藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）微珠，熒光素標記的單克隆抗體PE-CD11c、PE-CD11b、別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）-MHCⅡ和異硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）-CD86均購于美國BD公司。 Lysing buffer購自美國Thermo公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immune absorbent assay，ELISA）試劑盒購于美國BD公司。

1.3 細胞制備

取出18只BN大鼠雙側(cè)帶雙關(guān)節(jié)股骨后置于超凈臺，用無菌組織剪剪斷兩端骨質(zhì)，暴露骨髓腔，用5 mL注射器吸取適量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重復多次沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白。足量收集組織細胞沖洗液，1000×g離心 15 min，棄上清，用RPMI1640培養(yǎng)液輕柔重懸細胞并調(diào)整細胞數(shù)為 2×106/L，接種于 6 孔板中，加入重組大鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、rrIL-4，隔日計數(shù)細胞并半量換液，適時對相關(guān)因子進行補充，至第7日足量收集懸浮細胞，1000×g離心并重懸后進行磁珠CD11b/c分選、流式細胞術(shù)鑒定，陽性率>95%的細胞樣本用于回輸。

1.4 模型建立與標本收集

根據(jù)既往研究報道，以BN大鼠肝臟為供肝，Lewis大鼠為受體的肝移植模型可以自發(fā)產(chǎn)生免疫耐受；而以Lewis大鼠肝臟為供肝，BN大鼠為受體的肝移植模型會發(fā)生明顯的AR[7]。本研究采用“雙袖套法”建立BN→Lewis的大鼠肝移植自發(fā)耐受模型（耐受組，n=6）和Lewis→BN的大鼠肝移植AR模型，AR模型大鼠中實驗組進行tolDC治療性回輸（tolDC組，n=6），對照組無干預措施（AR組，n=6）。tolDC組術(shù)前7 d、術(shù)后7 d和28 d分別經(jīng)尾靜脈注射從大鼠骨髓組織中分離出的tolDC懸液500 μL（含1×106個細胞），tolDC組受體大鼠死亡后立即采集足量外周血樣本和組織標本，術(shù)后7 d采集AR組受體大鼠外周血樣本和組織標本，術(shù)后100 d采集耐受組受體大鼠外周血樣本和組織標本，分別用于tolDC亞群分析以及組織病理學分析。

1.5 檢測方法

1.5.1 肝組織病理學檢查提取各組大鼠約0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小肝組織，甲醛固定、脫水、包埋，切片后進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡下觀察組織細胞一般形態(tài)并采集圖像。

1.5.2 大鼠外周血tolDC流式分析分別取100 μL外周血，依次加入抗體PE-CD11c、PE-CD11b、APCMHCⅡ、FITC-CD86檢測mDC與pDC，加入相應的抗體后震蕩混勻，室溫25 ℃暗室孵育15 min，加入1×Lysing buffer繼續(xù)孵育15 min，加入PBS，180×g離心6 min，棄上清，采用流式細胞儀進行檢測。

1.5.3 移植肝、脾臟、淋巴結(jié)tolDC流式分析將移植肝、脾臟、腹腔淋巴結(jié)組織分別置于超凈臺充分研磨，以200目篩網(wǎng)過濾，以Ficoll法4 ℃、180×g離心35 min，提取單個核細胞，加入PBS充分吹打混勻，25 ℃、180×g離心6 min，棄上清，加入PBS，分別提取100 μL細胞懸液進行檢測，免疫抗體染色同外周血，恒溫孵育結(jié)束后，加入PBS，180×g離心6 min，棄上清，采用流式細胞儀進行檢測。

1.5.4 ELISA檢測白細胞介素-10與干擾素-γ利用ELISA法檢測各組細胞懸液白細胞介素（interleukin，IL）-10以及干擾素（interferon，IFN）-γ的表達情況，具體方法步驟參照美國BD公司ELISA試劑盒說明書。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后生存時間和移植肝病理學表現(xiàn)

以Lewis大鼠肝臟為供肝，BN大鼠為受體的AR組大鼠肝移植術(shù)后產(chǎn)生明顯的AR，生存時間7～14 d，組織病理學表現(xiàn)主要為炎癥細胞浸潤和組織結(jié)構(gòu)紊亂（圖1A）；以BN大鼠肝臟為供肝，Lewis大鼠為受體的耐受組大鼠75%以上均可以產(chǎn)生自發(fā)性耐受，生存時間均超過100 d（圖1B）；而過繼輸注tolDC后可以延長AR大鼠的生存時間，最短生存時間45 d，中位生存時間67 d，最長生存時間102 d，移植肝的組織形態(tài)基本接近耐受大鼠，僅在匯管區(qū)有淋巴細胞浸潤（圖1C）。

2.2 各組大鼠外周血、移植肝、脾臟、淋巴結(jié)mDC表達情況

與AR組比較，耐受組和tolDC組大鼠外周血、移植肝、脾臟、淋巴結(jié)中CD11+mDC水平均下降（均為P<0.05）；與耐受組比較，tolDC組大鼠外周血、移植肝、脾臟、淋巴結(jié)中CD11+mDC水平差異均無統(tǒng)計學意義（均為P>0.05，圖2）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與AR組比較，耐受組和tolDC組大鼠mDC表面共刺激分子CD86、MHCⅡ表達水平均降低（均為P<0.05，圖3）。

2.3 各組大鼠外周血、移植肝、脾臟、淋巴結(jié)pDC表達情況

與AR組比較，耐受組和tolDC組大鼠外周血、移植肝、脾臟、淋巴結(jié)中pDC的水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P<0.05，圖4A）；與AR組比較，耐受組和tolDC組大鼠外周血、移植肝、脾臟、淋巴結(jié)中pDC表面MHCⅡ表達水平均降低（均為P<0.05，圖4B）。

2.4 各組大鼠血清IL-10和IFN-γ表達情況

與AR組的血清IL-10表達水平[（2.3±0.6）pg/mL]比較， 耐受組 [（8.4±1.3）pg/mL]和 tolDC組[（6.8±1.6）pg/mL]大鼠血清 IL-10的表達水平均升高（均為P<0.05）；與AR組的IFN-γ表達水平[（16.1±2.9）pg/mL]比較，耐受組[（7.5±0.9）pg/mL]和 tolDC 組 [（8.0±1.2）pg/mL]大鼠血清IFN-γ的表達水平均降低（均為P<0.05）。

3 討 論

盡管免疫抑制劑的使用為肝移植受者的長期生存提供了可能，但是免疫抑制劑所帶來的諸如術(shù)后感染、腫瘤復發(fā)等問題也不容忽視[8]，因此，找到一種可行的方式抑制肝移植術(shù)后AR是臨床中亟待解決的問題之一。樹突狀細胞主要包括mDC與pDC兩大類，除了抗原提呈功能外[9-11]，多數(shù)研究表明tolDC能夠通過表達低水平MHCⅡ類分子誘導T細胞無能或凋亡及促進調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）分化發(fā)育從而抑制免疫反應發(fā)生[12-14]，但是pDC和mDC在肝移植免疫耐受中的共同作用及兩者之間的相互比較相關(guān)研究較少。隨著細胞治療在免疫領(lǐng)域的發(fā)展，通過過繼回輸樹突狀細胞等方式對肝移植術(shù)后AR進行干預，有望徹底解決肝移植術(shù)后移植物長期生存的問題[15-16]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，pDC、tolDC都有可能通過誘導CD8+CD45RClowTreg介導大鼠肝移植免疫耐受[17-18]，但是，在免疫耐受發(fā)生中是否同時存在pDC與mDC的變化與相互作用需要進一步探討。在本研究中，利用誘導分化骨髓來源tolDC回輸干預能夠明顯延長肝移植術(shù)后大鼠生存期，達到免疫耐受的狀態(tài)，其移植肝組織病理學表現(xiàn)與自發(fā)耐受大鼠無明顯差異。利用該tolDC回輸大鼠與自發(fā)耐受大鼠體內(nèi)的變化作為分析的標準，并以AR大鼠作為對照，發(fā)現(xiàn)不管是人為誘導發(fā)生耐受還是自發(fā)性耐受大鼠，mDC的表達均處于較低水平，同時低表達MHCⅡ與CD86，而CD86在成熟樹突狀細胞表面大量表達[19]。CD11參與細胞的識別、活化和信號傳導，故在細胞活化時分泌增多[20-21]。mDC表面的CD86是T細胞表面CD28與細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4的配體，CD86與CD28的親和力改變，使得該通路的信號轉(zhuǎn)導誘導T細胞激活，降低CD86的表達有助于T細胞的無能，促進耐受的發(fā)生[22-24]，本研究與既往文獻報道一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)tolDC回輸大鼠、耐受大鼠的pDC表達水平升高，這與筆者前期研究結(jié)果一致，同時其表面低表達MHCⅡ類分子。在體外，人pDC誘導T細胞分化為產(chǎn)生IL-10的Treg[25-27]，輔助性T細胞（helper T cell，Th）1/Th2的偏移有助于免疫耐受的發(fā)生[28]。在本研究中，tolDC回輸大鼠與耐受大鼠IL-10的表達水平均升高，通過直接或間接方式促進T細胞分化成熟，從而導致增強免疫應答的表面因子IFN-γ水平降低[29]。這些均提示在免疫耐受的過程中低表達共刺激分子的mDC和pDC共同發(fā)揮作用。

在本研究中，回輸tolDC大鼠外周血、移植肝、脾臟、淋巴結(jié)的mDC和pDC的變化與自發(fā)耐受大鼠的變化一致，進一步提示低表達共刺激分子的mDC和pDC在免疫耐受中均發(fā)揮促進效應。pDC可能主要通過誘導分泌IL-10的Treg發(fā)揮作用，而低表達共刺激分子的mDC主要通過誘導Treg生成和誘導T細胞無能發(fā)揮作用，但是本研究僅為現(xiàn)象層面的觀察，二者之間的相互作用機制仍需要進一步探討。

綜上所述，作為tolDC亞群，pDC和mDC在肝移植術(shù)后移植物免疫耐受發(fā)生過程中均發(fā)揮著正向調(diào)節(jié)作用。