馬振寰 崔彩云 李言君

[摘要]根尖牙乳頭干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞，是牙根部成牙本質(zhì)細(xì)胞的重要來源，在牙根部牙本質(zhì)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其在多種因素作用下能夠向成骨和成牙本質(zhì)方向分化，具有形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的能力。誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨和成牙本質(zhì)方向分化，尤其是促進(jìn)根尖孔未閉合的年輕恒牙牙根繼續(xù)發(fā)育，對(duì)于患牙保存具有重要意義。本研究從生物活性材料及支架、炎癥微環(huán)境、物理化學(xué)因素和基因轉(zhuǎn)染等方面回顧了影響根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨和成牙本質(zhì)方向分化的誘導(dǎo)因素，其中細(xì)胞外基質(zhì)材料、硅酸鹽類生物活性材料和炎癥微環(huán)境的相關(guān)研究對(duì)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生具有更顯著的作用優(yōu)勢(shì)。

[關(guān)鍵詞]根尖牙乳頭干細(xì)胞;成牙本質(zhì)細(xì)胞;成牙本質(zhì)分化;成骨分化

[中圖分類號(hào)] R781.3? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A?? [文章編號(hào)]2095-0616（2022）08-0048-04

2006年Sonayama等首次分離根尖牙乳頭細(xì)胞，命名為根尖牙乳頭干細(xì)胞（stem cell from the? apical papilla， SCAP），這類細(xì)胞具有多向分化潛能，是牙根部成牙本質(zhì)細(xì)胞的重要來源，在牙根部牙本質(zhì)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1]。牙根未完全發(fā)育的年輕患牙因牙髓和根尖周炎癥造成牙根發(fā)育停滯，在實(shí)施根尖誘導(dǎo)成形術(shù)后，根尖周組織中的根尖牙乳頭干細(xì)胞等能夠作為干細(xì)胞來源促進(jìn)牙根的延長(zhǎng)和管腔的縮窄促進(jìn)牙根發(fā)育。探尋促進(jìn)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨和成牙本質(zhì)方向分化的理想誘導(dǎo)微環(huán)境，對(duì)實(shí)現(xiàn)再生牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體用于治療牙髓及根尖周病的年輕恒牙具有重要意義。

1生物活性材料

1.1 生長(zhǎng)因子

生長(zhǎng)因子是一類通過與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與其他細(xì)胞功能等多效應(yīng)的多肽類物質(zhì)，近年研究主要涉及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone， PTH）和1，25-二羥基維生素 D3。TGF-β是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，1 ng/ml TGF-β2體外促進(jìn)人 SCAP 牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein， DSPP）和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（dentin matrix protein 1， DMP-1）表達(dá)，抑制骨涎蛋白（bone sialoprotein， BSP）表達(dá)， TGF-β2體外促進(jìn) SCAP 成牙本質(zhì)方向分化[2]。PTH 促進(jìn)人 SCAP 體外細(xì)胞增殖、骨鈣素（osteocalcin， OCN）、骨橋蛋白（osteopontin， OPN）、osterix（OSX）、runt-related transcription? factor 2（RUNX2）、膠原蛋白Ⅰ型（collagen type Ⅰ， COL-I）、DSPP 基因和蛋白表達(dá)，促進(jìn) SCAP 成骨和成牙本質(zhì)方向分化[3]。1，25-二羥基維生素 D3 是調(diào)節(jié)人體鈣磷代謝的重要激素，也是細(xì)胞生長(zhǎng)分化、免疫系統(tǒng)功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，體外促進(jìn) SCAP 黏附、增殖和 Runx2、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、COL-I 和 OCN 表達(dá)，促進(jìn) SCAP 成骨方向分化[4]。

1.2 細(xì)胞外基質(zhì)

細(xì)胞外基質(zhì)富含多種細(xì)胞因子、生物活性蛋白等在促進(jìn) SCAP 成骨成牙本質(zhì)方向分化中具有重要的作用。近年來的相關(guān)研究主要包括人血小板裂解物（human platelet lysate， HPL）、血小板衍生生長(zhǎng)因子 BB（platelet derived growth factor， PDGFBB）、富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin， PRF）和濃縮生長(zhǎng)因子（concentrate growth factors， CGF）。HPL 是一種來源于人血小板的無異種源、無動(dòng)物血清的產(chǎn)物，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的所有生長(zhǎng)因子和蛋白質(zhì)，HPL 體外促進(jìn)接種于 PLGA 支架的 SCAP 增殖、黏附和 ALP、OPN、OCN 表達(dá)[5]。 PDGFBB 體外促進(jìn) SCAP 的增殖， PDGFBB 水凝膠促進(jìn)大鼠顱骨缺損模型中新骨的形成和礦化[6]。 PRF 含大量生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，CGF 是新一代血漿提取物，富含濃縮生長(zhǎng)因子和纖維蛋白，在骨再生方面優(yōu)于 PRF。PRF 條件培養(yǎng)液顯著促進(jìn)SCAP 體外遷移、ALP、DMP-1表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的形成， PRF 通過 ERK 信號(hào)通路促進(jìn) SCAP 成骨和成牙本質(zhì)方向分化[7]。

1.3 無機(jī)生物活性材料

常用的生物活性材料為硅酸鹽生物活性材料，如三氧化二礦物集合體（mineral trioxide aggregate， MTA）、BD（bio-dentin）、ProRoot、iRoot Fast Set? root repair material（iRoot FS）等。MTA 通過激活 p38和 ERK 信號(hào)通路促進(jìn) SCAP 向成骨方向分化[8]。IRoot FS 增強(qiáng) SCAP 礦化能力，促進(jìn) DSPP、ALP 基因和蛋白表達(dá)，作用優(yōu)于 MTA[9]。硅酸鹽材料促進(jìn) SCAP 體外礦化、成骨和成牙本質(zhì)方向分化[10-11]。這些硅酸鹽材料體外誘導(dǎo) SCAP 的礦化、成骨和成牙本質(zhì)方向分化，從而促進(jìn)其在再生性牙髓治療中的應(yīng)用。

目前，細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)及其支架材料并未廣泛應(yīng)用于臨床。大量研究表明 SCAP 體外有很強(qiáng)的成骨和成牙本質(zhì)方向分化能力，但缺乏動(dòng)物異位及臨床原位再生的研究。TGF-β2具有抑制骨形成和促進(jìn)成牙本質(zhì)方向分化的能力，對(duì)于牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生研究具有重要研究?jī)r(jià)值;血液來源的 HPL、PDGFBB、PRF 和 CGF 有良好的臨床應(yīng)用前景，需要大量實(shí)驗(yàn)研究提供臨床應(yīng)用基礎(chǔ);硅酸鹽材料可刺激膠原、前列腺素等基因上調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多的礦化基質(zhì)，其生物相容性及生物安全性在臨床中被廣泛認(rèn)可，且已取得了良好的臨床治療效果，具有良好的應(yīng)用前景，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

2炎癥微環(huán)境

由于炎癥因子的表達(dá)及抗菌成分的不同， SCAP 在炎癥微環(huán)境下的分化也會(huì)受到影響，目前研究的影響因素主要有脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）和抗菌肽等。LPS 是革蘭陰性菌的主要成分，在成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞和 SCAP 中作為內(nèi)毒素誘導(dǎo)多種免疫反應(yīng)。0.1μg/ml LPS 促進(jìn) SCAPs 細(xì)胞增殖、ALP 活性、礦化結(jié)節(jié)形成和 DSPP、RUNX2、BSP 表達(dá)，通過 ERK 和 P38信號(hào)通路促進(jìn) SCAPs 成骨和成牙本質(zhì)方向分化[12]。5 mg/ml LPS 可抑制 SCAP 細(xì)胞增殖、礦化結(jié)節(jié)形成和 DMP-1、RUNX-2和 ALP 的表達(dá)，5 mmol/L 的自噬抑制劑3-MA 逆轉(zhuǎn) LPS 引起的礦化結(jié)節(jié)形成和 DMP-1、RUNX-2和 ALP 的表達(dá)，證實(shí)細(xì)胞自噬在 LPS 誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境中參與 SCAP 成骨和成牙本質(zhì)方向分化的抑制[13]，自噬調(diào)節(jié)可能作為一種新的策略，促進(jìn) SCAP 在炎癥環(huán)境下的成骨和成牙本質(zhì)方向分化。1μg/ml 和5μg/ml LPS 增強(qiáng)小于根發(fā)育期的1/2的 SAPC（ER-APC）礦化能力和 BSP 表達(dá)，但1μg/ml 對(duì)根發(fā)育期的1/2～3/4 SAPC（LR-APC）的礦化及 BSP 表達(dá)無影響能力無影響，5μg/ml 可以促進(jìn) LR-APC BSP 表達(dá)，對(duì)礦化無影響，不同濃度的 LPS 可對(duì) SCAPs 產(chǎn)生不同的影響，相同濃度的 LPS 在 SCAPs 不同時(shí)期產(chǎn)生的影響有差異[14]?？咕?LL-37除了具有廣譜的抗菌功能，還能促進(jìn)牙齒形成和成骨，2.5 mg/ml LL-37促進(jìn) SCAP 的 DSP、 DMP-1、RUNX2、OSX 表達(dá)，2.5 mg/ml LL-37通過激活 Akt/Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn) SCAPs 遷移和成骨和成牙本質(zhì)方向分化[15]。綜上所述， SCAP 在體外模擬的炎性環(huán)境下受到影響與受到 LPS 濃度及作用時(shí)間有明顯相關(guān)性，研究多為細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)未見動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床報(bào)道。細(xì)胞代謝產(chǎn)物及抗菌成分與 SCAP 存在復(fù)雜的相互作用，探索如何控制炎癥減輕或消除其對(duì) SCAP 成骨和成牙本質(zhì)方向分化的抑制作用具有重要意義。

3其他因素

3.1 物理因素

影響根尖牙乳頭細(xì)胞分化的物理因素包括環(huán)境微剛度、支架彈性模量、光照等。SCAP 通過改變其細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架來響應(yīng)不同的底物硬度纖維連接蛋白與黏著斑塊中的黏著斑激酶（FAK）和帕西林相互作用，并且 FAK 和帕西林的表達(dá)隨著底物硬度的增加而增強(qiáng)[16]。多孔絲素支架的彈性模量（elastic modulus of porous silk fibroin? scaffolds）基質(zhì)的物理性質(zhì)（彈性模量）將成為干細(xì)胞分化為不同譜系的重要因素，SCAP 對(duì)海綿基質(zhì)模量在16～131 kPa 范圍內(nèi)表現(xiàn)出成骨敏感性， OPN、RUNX2、OCN 表達(dá)上調(diào)，多孔支架的成骨能力隨彈性模量的增加而增強(qiáng)，模量為83 kPa 的支架成骨能力最強(qiáng)[17]。低能量藍(lán)光照射促進(jìn) SCAP 的成骨分化，上調(diào) ALP、DSPP、DMP-1和 OCN 的表達(dá)水平[18]。200 g 機(jī)械牽張力能促進(jìn) SCAP 成牙本質(zhì)方向分化，提高 ALP、OSX、DSP mRNA 及蛋白的表達(dá)水平[19]。

3.2 化學(xué)因素

影響根尖牙乳頭細(xì)胞分化的化學(xué)藥物主要包括氟化鈉、信號(hào)通路抑制劑等。0.5 mM NaF促進(jìn) SCAP 礦化結(jié)節(jié)形成和 RUNX2、OSX、DSP、OCN 表達(dá)[20]。100 mg/L 乙酰水楊酸誘導(dǎo) SCAP 后聯(lián)合 PI3K-AKT 信號(hào)通路抑制劑 LY294402可以促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成，促進(jìn) SCAP 成牙本質(zhì)方向分化[21]。毛喉素（Forskolin）和 TGF-β1抑制劑共處理可提高 SCAP 的 ALP 活性和鈣礦物的沉積[22]。

3.3基因轉(zhuǎn)染相關(guān)因子

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是將純化的含靶基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮一定的功能。近年的研究主要集中在cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白123、微核糖核酸hsa-let-7（ MicroRNAhsa-let-7 ）24-25]、分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（ secretedfrizzled-related protein 2，SFRP2 ）[26l、無遠(yuǎn)端同源盒5 （distal-less homeobox 5，DLX5 ） 127。這部分研究結(jié)果為SCAP成骨和成牙本質(zhì)方向分化的功能調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，是作用機(jī)制研究的常用手段依據(jù)，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用受到局限。

4總結(jié)與展望

綜上所述，誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨和成牙本質(zhì)方向分化的影響因素主要包括生物活性材料及支架、炎癥微環(huán)境、物理化學(xué)因素和基因轉(zhuǎn)染等。上述研究中使用的細(xì)胞主要來源于鼠和人，可以根據(jù)獲取的難易程度以及實(shí)驗(yàn)需求選擇組織來源;體外研究中主要通過ALP染色、Realtime-PCR、Western blot等方法定量檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)量的高低來確定細(xì)胞成骨和成牙本質(zhì)方向分化;SCAP成骨和成牙本質(zhì)方向分化過程復(fù)雜、涉及Akt、Wnt和NF- xB等多條信號(hào)通路。目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道明確某一指標(biāo)升高或降低高即根尖牙乳頭干細(xì)胞發(fā)生成骨方向分化或成牙本質(zhì)方向分化。無免疫源性的血液來源細(xì)胞外基質(zhì)材料、硅酸鹽類生物活性材料或兩者材料的混合，炎癥微環(huán)境的相關(guān)研究有望成為牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的理想誘導(dǎo)微環(huán)境。

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（收稿日期：2021-11-15）