孫煒瑋，馬丹丹，董慶泰，李中虎，林振宇，金煒東，楊瑞

（中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科，湖北 武漢 430070）

目前，胰腺癌的發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)逐年上升，這意味著胰腺癌將構(gòu)成重大的公共衛(wèi)生負擔[1]。由于胰腺癌早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，而腫瘤的快速發(fā)展又使得臨床上診斷為胰腺癌的患者多為中晚期，失去了治療的最佳時機，所以胰腺癌的5年生存率很低[2]。因此胰腺癌的診斷和治療形勢是嚴峻的。為了改善胰腺癌的臨床療效，研究人員試圖根據(jù)腫瘤生物學和遺傳學來制定新的治療方案[3]。因此，探索具有高敏感性和特異性的胰腺癌預后生物標志物已成為近年來的研究熱點。

染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）參與維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和真核細胞的有絲分裂[4]。既往研究表明，SMC4在乳腺癌[5]、肝癌[6]、結(jié)腸癌[7]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[8]、肺 癌[9]、宮頸癌[10]等多種惡性腫瘤進展中發(fā)揮重要功能。但目前國內(nèi)外關(guān)于SMC4 在胰腺癌中功能、預后評估、信號通路的報道甚少，機制不明。因此，本研究基于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)明確SMC4 在胰腺癌中的mRNA表達情況，同時利用胰腺癌標本進一步驗證SMC4 在胰腺癌中的蛋白表達情況。繼而利用生物信息學技術(shù)分析其表達差異與臨床病理特征及預后的關(guān)系，并探討其可能參與的信號通路。為研究胰腺癌的早期診斷、病情監(jiān)測及預后判斷提供新思路。

1 資料和方法

1.1 SMC4在胰腺癌中表達的臨床分析

1.1.1 SMC4在胰腺癌組中的蛋白表達分析：對2020年7月至2021年6月在中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院接受根治性胰十二指腸切除術(shù)治療的12例胰腺癌患者的組織標本進行分析。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測SMC4在胰腺癌組織及配對癌旁組織中的表達。按照總蛋白抽提試劑盒操作說明提取蛋白。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。配置分離膠和濃縮膠，取等量蛋白樣本進行電泳分離。停止電泳，將全部蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，分別加入用封閉液稀釋的SMC4及β-actin單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，用TBST緩沖液（tris buffered saline tween）洗膜3次，每次10 min。再用封閉液稀釋二抗（1∶5 000），室溫搖床孵育1h，TBST洗膜3次，每次10 min?；瘜W發(fā)光試劑曝光檢測。蛋白條帶的灰度值通過灰度掃描儀分析獲得。

1.1.2 SMC4 在胰腺癌組織中的基因表達分析：在GEPIA（Gene Expression profiling interactive analysis）（http://gepia.cancer-pku.cn/）數(shù)據(jù)庫中設定條件為：“gene:SMC4”“expression diy:boxplot”“cancer type：

PAAD”，獲得SMC4 在胰腺癌組織與正常組織中的表達差異。納入數(shù)據(jù)資料為TCGA數(shù)據(jù)庫及GTEx數(shù)據(jù)庫，其中胰腺癌組織179例，均來自TCGA數(shù)據(jù)庫，正常胰腺組織171 例，其中4 例來自TCGA數(shù)據(jù)庫，167例來自GTEx數(shù)據(jù)庫。

1.1.3 SMC4 在胰腺癌組織中的mRNA表達分析：在TCGA下載的177例胰腺癌患者資料中，同時具有SMC4表達量數(shù)據(jù)及對應臨床病理資料的患者共173例。以胰腺癌患者SMC4 mRNA表達量的中位數(shù)為分割點將患者劃分SMC4 高表達組與SMC4 低表達組。采用Wilcoxon檢驗分析SMC4在胰腺癌組織中的mRNA表達差異。

1.2 生物信息學分析

1.2.1 SMC4相互作用蛋白網(wǎng)絡：STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫可根據(jù)文獻報道、數(shù)據(jù)庫收錄數(shù)據(jù)及分子間共表達蛋白相關(guān)性等證據(jù)給出蛋白質(zhì)間存在相互作用的可信度評分（score）。該分數(shù)越接近1，分子間存在相互作用的可信度越大，分數(shù)越接近0說明目前證據(jù)不足，可信度越低。在STRING中搜索蛋白質(zhì)名稱“SMC4”，選擇物種“Homo sapiens”，可獲取SMC4相互作用蛋白。

1.2.2 GSEA富集分析：GSEA（Gene set enrichment analysis）是基于JAVA語言的一款基因富集分析軟件，本研究利用GESA軟件進行KEGG通路富集分析。TCGA數(shù)據(jù)庫中55 268 個基因被納入分析。每次分析進行1 000次基因組排列。本次研究采用的基因集數(shù)據(jù)庫為“c2.cp.kegg.v7.2 symbols.gmt”。校正P值及錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）均＜0.05的基因組被認為具有顯著性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。SMC4在胰腺癌中的蛋白表達差異采用配對樣本t檢驗，SMC4 基因表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線。胰腺癌患者臨床病理特征和預后的關(guān)系采用單因素及多因素Cox回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SMC4在胰腺癌組織和癌旁組織中的蛋白表達差異

Western blotting檢測結(jié)果顯示SMC4在胰腺癌組織中的蛋白表達量高于癌旁組織[（1.658±0.043）vs（0.539±0.023）]，差異有統(tǒng)計學意義（t=79.541，P＜0.001）。見圖

圖1 SMC4在胰腺組織中的蛋白表達情況

2.2 SMC4 mRNA在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達差異

對GEPIA數(shù)據(jù)庫中，179例胰腺癌組織與171例正常胰腺組織對比分析顯示，SMC4 mRNA在胰腺癌組織中的表達量顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 SMC4在胰腺組織中的mRNA表達情況

2.3 SMC4基因表達水平與胰腺癌患者臨床病理特

征的關(guān)系

對TCGA數(shù)據(jù)庫的173例SMC4基因表達水平與胰腺癌患者的病理分級（χ2=10.005，P=0.019）和T分期（χ2=10.395，P=0.015）密切相關(guān)，與年齡、性別、病理分期、N分期、M分期無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中SMC4基因表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.4 胰腺癌臨床病理特征與預后的關(guān)系

單因素Cox分析結(jié)果顯示SMC4 mRNA表達水平（HR1.650，95%CI1.085～2.511，P=0.019）和N分期（HR2.001，95%CI1.193～3.354，P=0.009）對胰腺癌患者的預后存在顯著影響。進一步多因素Cox分析結(jié)果顯示SMC4 mRNA表達水平（HR1.549，95%CI1.005～2.389，P=0.047）和N分期（HR1.829，95%CI1.045～3.201，P=0.035）是胰腺癌患者預后的獨立危險因素。SMC4 mRNA表達水平越高提示胰腺癌不良預后的可能性更大。見表2。

表2 Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)庫中胰腺癌臨床病理特征與預后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)SMC4 mRNA表達水平的中位數(shù)將胰腺癌患者分為SMC4高表達組與SMC4低表達組。利用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線。結(jié)果表明SMC4 高表達組胰腺癌患者的中位生存時間顯著短于SMC4低表達組患者（19.73個月vs22.03個月，χ2=5.596，P=0.018），見圖3。

圖3 SMC4高表達組與SMC4低表達組胰腺癌患者的生存曲線

2.5 SMC4相互作用蛋白網(wǎng)絡

利用STRING數(shù)據(jù)庫分析人源SMC4 可能存在的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，結(jié)果表明：與SMC4相互作用Score排名前10 位的蛋白分別為NCAPH（Score=0.999）、NCAPG（Score=0.999）、SMC2（Score=0.999）、NCAPD2（Score=0.999）、NCAPD3（Score=0.999）、NCAPG2（Score=0.998）、NCAPH2（Score=0.997）、CDK1（Score=0.996）、PLK1（Score=0.991）、AURKB（Score=0.991）。見圖4。

圖4 SMC4相互作用蛋白網(wǎng)絡

2.6 SMC4功能GSEA富集分析

GSEA研究結(jié)果顯示：SMC4 mRNA高表達樣本富集到ERBB信號通路、Wnt信號通路、TGF-β信號通路、Notch信號通路、VEGF信號通路、JAK STAT信號通路等相關(guān)基因集，詳見表3。且SMC4 mRNA表達水平與上述通路中的基因表達呈正相關(guān)，即當SMC4基因表達上調(diào)時，上述通路被激活。

表3 SMC4的通路富集分析

3 討論

探索具有高敏感性和特異性的胰腺癌生物標志物是改善胰腺癌患者生存預后的關(guān)鍵措施之一[3]。SMC4在乳腺癌[5]、結(jié)直腸癌[7]、膠質(zhì)瘤[8]及肝癌[11]中高表達，參與了腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并與其不良預后密切相關(guān)。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于SMC4在胰腺癌功能及機制方面的研究甚少。

本研究基于本院臨床樣本及生物信息學技術(shù)，系統(tǒng)分析了SMC4 在胰腺組織中的差異表達，并全面評估其表達差異對胰腺癌預后的診斷價值。分析結(jié)果顯示，SMC4 在胰腺癌組織中的表達顯著高于正常胰腺組織。SMC4 高表達組胰腺癌患者的生存時間顯著低于SMC4低表達組患者，進一步Cox回歸分析結(jié)果證實，SMC4 高表達可能是胰腺癌獨立的不良預后因子。Huang等[5]報道SMC4高表達和表皮生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）高表達水平均是導致三陰性乳腺癌發(fā)生的危險因素，可作為輔助診斷指標。SMC4的高表達是結(jié)直腸癌患者生存率不佳的一個獨立危險因素[12-13]。SMC4在膠質(zhì)瘤組織中的蛋白和mRNA表達水平均顯著高于正常腦組織，SMC4 表達升高與腫瘤進展和膠質(zhì)瘤患者總體生存率有關(guān)，是膠質(zhì)瘤藥物治療中的一個有價值的預后因素和潛在靶點[8，14]?？梢奡MC4可能是胰腺癌的一個獨立預后因子，可為胰腺癌的早期診斷提供重要的支持證據(jù)。

SMC4 在胰腺癌中的功能不明確，Pandey等[15]報道SMC2 與SMC4 是相互作用蛋白，在瘧原蟲生命周期的非典型有絲分裂中起著關(guān)鍵作用，可能在不同的增殖階段發(fā)揮不同的功能，它們的去除或消耗會導致寄生蟲的發(fā)育受損，并阻止傳播。Robellet等[16]報道SMC4與CDK1相互作用增加癌細胞增殖，且SMC4 的高表達可促進PLK1 的上調(diào)進而增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄活性及相關(guān)細胞入侵。上述研究結(jié)果證實SMC4通過與相互作用蛋白SMC2、CDK1、PLK1作用發(fā)揮功能。本研究結(jié)果提示與SMC4 相互作用的蛋白還有NCAPH、NCAPG、NCAPD2、NCAPD3、NCAPG2、NCAPH2、AURKB等，可為SMC4的功能研究提供新線索。

目前，SMC4 在胰腺癌中發(fā)揮功能的具體機制不明。Huang等[5]報道當SMC4 表達下調(diào)時，PI3K/AKT信號通路的激活失效，從而抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移。SMC4在肝癌中表達上調(diào)，可有效促進肝癌進展及侵襲[6，11]。但miR-219表達水平增加可導致SMC4表達水平顯著下降，進而下調(diào)JAK2/Stat3的表達，在肝癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用。Jiang等[14]的研究結(jié)果表明過表達SMC4通過激活TGF-β/Smad信號通路促進膠質(zhì)瘤細胞增殖率、遷移和侵襲能力。本研究利用GSEA富集分析預測SMC4在胰腺癌中發(fā)揮功能的可能信號通路有JAK STAT信號通路、TGF-β信號通路，與文獻報道[17]一致。除此之外，還預測到ERBB信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路、VEGF信號通路等，可為SMC4在胰腺癌中的機制研究提供更多線索和思路，值得進一步探討與證實。

綜上所述，SMC4在胰腺癌中高表達，且與胰腺癌不良預后密切相關(guān)，表現(xiàn)為癌基因特性，可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌作用，有望成為胰腺癌診治的新靶點和生物學標志物。