■衛(wèi)力博 彭祖想 嚴(yán) 林 高 欣 翟浩杰 王 偉，2 任同軍，2 韓雨哲，2*

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

許氏平鲉又名黑鲪、黑寨，屬近岸底層肉食性魚類，具有抗病性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富和生長(zhǎng)快速等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)北方沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚類[1-2]。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，許氏平鲉養(yǎng)殖產(chǎn)量逐步上升，對(duì)飼料的需求也不斷增加，魚粉作為水產(chǎn)飼料中最重要的蛋白源，由于資源有限，價(jià)格上漲等原因已經(jīng)嚴(yán)重影響了其養(yǎng)殖效益[3]。為了節(jié)約飼料成本，通常以成本低廉且資源豐富的植物蛋白源（豆粕、菜粕、花生粕等）進(jìn)行魚粉替代，但植物蛋白源除了存在蛋白酶抑制劑、硫代葡萄糖苷等大量?jī)?nèi)源性抗?fàn)I養(yǎng)因子外，還缺乏某些在魚類生長(zhǎng)過程中所需的重要氨基酸，如?；撬帷⒌鞍彼岬萚4-5]。

?；撬?，化學(xué)名稱2-氨基乙磺酸，是含硫氨基酸代謝的最終產(chǎn)物，作為動(dòng)物體含量最豐富的游離氨基酸，具有誘食、促生長(zhǎng)、參與膽汁酸調(diào)節(jié)與滲透調(diào)節(jié)、提高免疫和抗氧化能力等功能[6-8]。魚類具有一定的?；撬岷铣赡芰Γ毡檩^弱，無法滿足自身需求，特別是肉食性魚類[9]。目前研究已表明，通過在低魚粉飼料中添加?；撬峥筛纳浦参锏鞍自磳?dǎo)致的生長(zhǎng)緩慢和綠肝綜合征等現(xiàn)象，起到節(jié)約魚粉的效果。Takagiet等[10-11]報(bào)道在低魚粉高植物蛋白飼料中添加?；撬?，能夠顯著改善鲉魚和紅鯛的生長(zhǎng)性能并降低了綠肝綜合征的發(fā)病率。劉興旺等[12]研究表明，在植物蛋白替代魚粉條件下補(bǔ)充?；撬峥纱龠M(jìn)大菱鲆生長(zhǎng)，并緩解植物蛋白所導(dǎo)致的脂肪代謝異?，F(xiàn)象。目前許氏平鲉飼料研究主要集中在動(dòng)植物蛋白源替代不同比例魚粉上[13-15]，而關(guān)于補(bǔ)充功能性添加劑來提高低魚粉飼料利用率和緩解低魚粉飼料所帶來的負(fù)面效果上的研究甚少[16]。本試驗(yàn)通過在低魚粉飼料中添加?；撬?，探究其對(duì)許氏平鲉腸道結(jié)構(gòu)、免疫和抗氧化能力的影響，以期為許氏平鲉低魚粉飼料中?；撬岬氖褂锰峁├碚搮⒖?。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)用許氏平鲉購(gòu)自大連飛鯤水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，選取規(guī)格均一、健康無傷的平均體質(zhì)量為（36.25±0.04）g 的許氏平鲉120 尾，暫養(yǎng)1 周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件，期間投喂對(duì)照組基礎(chǔ)飼料。

1.2 試驗(yàn)飼料

以豆粕、魚粉為主要蛋白源，魚油為主要脂肪源，配制牛磺酸水平分別為0（T1 組，對(duì)照組）、0.8%（T2 組）、1.6%（T3 組）、2.4%（T4 組）、3.2%（T5 組）的5種等能低魚粉飼料。?；撬幔ê?9%）購(gòu)自湖北遠(yuǎn)大生命科學(xué)與技術(shù)有限責(zé)任公司。甘氨酸的含量隨飼料中?；撬岷康脑黾佣鴾p少以保證各試驗(yàn)飼料氮的含量一致。所有飼料原料粉碎過60 目篩，原料按照配方進(jìn)行逐級(jí)混勻，期間添加適量的水使其黏合度適宜，經(jīng)制粒機(jī)制成2 mm 顆粒飼料，于40 ℃烘箱中烘至水分為10%左右，晾至室溫后存于密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，試?yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)開始前，停食24 h，將試驗(yàn)用魚隨機(jī)分成5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8尾魚，共計(jì)15個(gè)水槽，置于循環(huán)水設(shè)施中養(yǎng)殖。養(yǎng)殖周期為56 d，每天8：00 和17：00 投喂試驗(yàn)飼料至表觀飽食，每日18：30 進(jìn)行換水，換水量為總水體的1/3。養(yǎng)殖期間，24 h 連續(xù)充氣，控制水溫17～19 ℃，溶解氧濃度大于6 mg/L，pH 7.3～7.8。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，所有魚[平均終末體質(zhì)量（49.37±1.26）g]進(jìn)行禁食24 h處理，每個(gè)養(yǎng)殖水槽隨機(jī)選3尾魚取1 cm 中腸，用4%多聚甲醛固定，用于制作腸道組織切片；剩余試驗(yàn)魚截取完整前腸和肝臟置于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱（-80 ℃）中保存進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.5 酶活性指標(biāo)測(cè)定

腸道消化酶包括淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）和蛋白酶（PRO），肝臟免疫酶包括堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和溶菌酶（LZM），肝臟抗氧化指標(biāo)包括過氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA），上述指標(biāo)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司，并參照說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.6 腸道組織形態(tài)觀察

腸道樣品經(jīng)乙醇脫水后置于二甲苯中透明，隨后進(jìn)行石蠟包埋處理，使用切片機(jī)橫向間隔切片，而后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡拍照后用圖像軟件S-Viewer 進(jìn)行觀察測(cè)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”表示。使用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan’s 法進(jìn)行組間差異分析，設(shè)置差異顯著為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道消化酶活性的影響（見表2）

由表2可知，T2、T3和T4組淀粉酶和脂肪酶均顯著高于對(duì)照組（T1組）（P<0.05），T5組與對(duì)照組相比無顯著差異（P>0.05）。T2組腸道蛋白酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），之后隨著牛磺酸添加量的增加，蛋白酶活性有所下降。

表2 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道消化酶活性的影響（n=3，U/mg prot.）

2.2 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道結(jié)構(gòu)的影響（見圖1、表3）

由圖1可知，對(duì)照組許氏平鲉中腸皺襞高度較低，皺襞破損嚴(yán)重，而?；撬崽砑咏M許氏平鲉腸道皺襞無明顯損傷脫落情況，皺襞整齊排列，由表3 可知，T2、T3組皺襞高度和皺襞寬度顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

表3 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道形態(tài)的影響（n=3，μm）

圖1 許氏平鲉腸道組織結(jié)構(gòu)

2.3 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉肝臟免疫指標(biāo)的影響（見表4）

由表4可知，與對(duì)照組相比，T2和T3組堿性磷酸酶、溶菌酶活性顯著提高（P<0.05）；各牛磺酸添加組的酸性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且隨著?；撬岷康纳哂邢陆第厔?shì)，但差異不顯著（P>0.05）。

表4 低魚粉飼料中添加牛磺酸對(duì)許氏平鲉肝臟免疫指標(biāo)的影響（n=3）

2.4 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉肝臟抗氧化能力的影響（見表5）

表5 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉肝臟抗氧化能力的影響（n=3）

由表5可知，T2組過氧化氫酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。?；撬崽砑咏M丙二醛含量相較于對(duì)照組顯著下降（P<0.05），且隨著?；撬崽砑恿康脑黾佑猩仙厔?shì)。各組間總超氧化物歧化酶活性無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

3.1 低魚粉飼料中添加牛磺酸對(duì)許氏平鲉腸道健康的影響

魚類腸道消化酶是反映魚體消化生理機(jī)能的重要指標(biāo)，可以直接影響魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用情況[17]。試驗(yàn)結(jié)果表明在低魚粉飼料中添加適宜?；撬峥稍鰪?qiáng)許氏平鲉腸道脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶活性，提升魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。研究表明?；撬嵩隰~體內(nèi)會(huì)與膽酸、鵝脫氧膽酸等游離膽酸合成?；悄懰岷团；蛆Z脫氧膽酸，結(jié)合膽汁酸的增加進(jìn)而會(huì)激活魚體內(nèi)膽鹽刺激脂酶來分解脂肪[18-20]，對(duì)脂肪酶活性具有促進(jìn)作用；淀粉酶活性的提升一方面與牛磺酸提升機(jī)體α-淀粉酶基因的相對(duì)表達(dá)量有關(guān)[21]，另一方面牛磺酸會(huì)刺激胰島素的釋放來血糖降低，從而間接促使淀粉酶活性升高進(jìn)行葡萄糖分解；此外適量牛磺酸還會(huì)刺激魚體蛋白酶分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化吸收[22]。

腸道皺襞高度、寬度以及肌層厚度會(huì)直接影響腸道的完整性和穩(wěn)固性，對(duì)魚體健康極為重要。低魚粉高植物蛋白飼料因存在大量抗?fàn)I養(yǎng)因子和適口性差等原因會(huì)對(duì)魚類腸道造成損傷，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示通過添加牛磺酸可以明顯修復(fù)許氏平鲉腸道的損傷狀態(tài)，提升腸道皺襞高度及寬度。據(jù)相關(guān)報(bào)道牛磺酸不僅作為結(jié)腸上皮細(xì)胞中含量最豐富的游離氨基酸，與上皮細(xì)胞增殖和腸道結(jié)構(gòu)的變化相關(guān)[23]，還會(huì)通過調(diào)節(jié)TLRs/NF-κB 信號(hào)通路，下調(diào)腸道促炎因子與上調(diào)抗炎因子的表達(dá)，緩解高植物蛋白引起的腸道炎癥，保持腸道健康生長(zhǎng)[24]。但隨著?；撬崽砑恿康纳仙?，許氏平鲉腸道消化酶活性、皺襞高度及寬度有下降趨勢(shì)，在青魚[25]、花鰻鱺[26]的研究上也得到了類似結(jié)果，其原因可能是魚類攝入過量?；撬釙?huì)導(dǎo)致腸道處于高酸度環(huán)境，抑制腸道擬桿菌門等一些參與營(yíng)養(yǎng)代謝的優(yōu)勢(shì)菌群生長(zhǎng)[27]和腸道α-淀粉酶基因的相對(duì)表達(dá)[21]，進(jìn)而對(duì)腸道健康造成嚴(yán)重?fù)p傷。

3.2 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉免疫水平的影響

?；撬嶙鳛闄C(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞中含量最豐富的游離氨基酸，具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白介素、促進(jìn)免疫球蛋白分泌和增強(qiáng)中性粒細(xì)胞吞噬殺菌能力等多種生物學(xué)功能[28]。溶菌酶可水解致病菌細(xì)胞壁的肽聚糖，致其內(nèi)容物流出，加速細(xì)菌溶解[29]；堿性磷酸酶存在機(jī)體各組織中，可通過改變細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)，加速吞噬細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行吞噬降解[30]；酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，而溶酶體通過水解致病菌來達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用[31]。本試驗(yàn)中，飼料中添加0.8%牛磺酸會(huì)顯著增強(qiáng)許氏平鲉肝臟溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，表明適量的牛磺酸對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫具有重要作用，此外Zhang 等[32]在探究?；撬釋?duì)黃顙魚急性氨中毒的緩解作用時(shí)也有相同的發(fā)現(xiàn)，牛磺酸可以有效遏制試驗(yàn)魚體內(nèi)溶菌酶活性和細(xì)胞吞噬指數(shù)下降的現(xiàn)象。但當(dāng)?；撬崽砑恿吭?.6%～3.6%時(shí)，許氏平鲉肝臟免疫酶活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這一結(jié)果與青魚[25]、草魚[33]、紅鰭東方鲀[34]的研究上相同，說明過多的?；撬釙?huì)對(duì)魚體免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制作用，相關(guān)研究表明過量的?；撬釙?huì)上調(diào)魚類的促炎細(xì)胞因子，肝臟健康程度下降，導(dǎo)致機(jī)體免疫酶活性降低[35]。此外腸道健康與魚體健康水平息息相關(guān)，過多的牛磺酸攝入時(shí)腸道受損，同樣會(huì)使機(jī)體的免疫水平下降[36]。

3.3 低魚粉飼料中添加牛磺酸對(duì)許氏平鲉抗氧化能力的影響

相關(guān)研究表明，牛磺酸會(huì)與機(jī)體內(nèi)次氯酸結(jié)合生成?；锹劝?，而?；锹劝窌?huì)激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路，從而上調(diào)抗氧化酶的相對(duì)基因表達(dá)[37]，此外牛磺酸作為線粒體蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)器，具有增強(qiáng)電子傳遞鏈活性并保護(hù)線粒體免受過量超氧化物影響的作用，進(jìn)而提升機(jī)體的抗氧化能力[38]。本試驗(yàn)研究中，飼料中添加?；撬崽岣吡诉^氧化氫酶活性并顯著降低了丙二醛的含量，表明?；撬岽龠M(jìn)了魚體對(duì)氧自由基的清除能力，降低了脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，緩解了許氏平鲉攝食高植物蛋白飼料后機(jī)體的氧化損傷程度。Rosemberg 等[39]在探究?；撬釋?duì)乙醇急性誘導(dǎo)斑馬魚大腦氧化應(yīng)激后的保護(hù)效果時(shí)也有相同發(fā)現(xiàn)，150 mg/L 和400 mg/L ?；撬峥捎行б种浦|(zhì)過氧化并提升過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性。此外本試驗(yàn)中當(dāng)牛磺酸添加量超過0.8%時(shí)過氧化氫酶活性有降低趨勢(shì)，丙二醛含量有上升趨勢(shì)，表明適宜的?；撬岷繉?duì)機(jī)體抗氧化能力具有提升作用，而含量過高可能會(huì)產(chǎn)生抑制作用，其原因可能是過高?；撬崴綍?huì)使魚類肝臟出現(xiàn)肝竇擴(kuò)張現(xiàn)象，加速肝細(xì)胞與血液之間的物質(zhì)交換，降低血清中白蛋白、球蛋白含量，打破了肝臟代謝平衡，使肝臟健康受損，機(jī)體的抗氧化能力下降[40]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過在低魚粉飼料中添加?；撬犸曫B(yǎng)許氏平鲉56 d后發(fā)現(xiàn)，適量牛磺酸可提升許氏平鲉腸道脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性并改善其腸道結(jié)構(gòu)，提高肝臟免疫及抗氧化能力，但過量牛磺酸會(huì)對(duì)魚體產(chǎn)生不利的影響，根據(jù)腸道健康指標(biāo)，建議許氏平鲉低魚粉飼料?；撬嶙钸m添加范圍為0.8%～1.6%。