孫敏佳， 劉曄宏， 薛依桐， 徐 俊， 王 彤， 徐首紅， 張俊琪

（ 1. 華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，結(jié)構(gòu)可控先進功能材料及其制備教育部重點實驗室，上海200237；2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)建委醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室&病原生物系，上海 200032）

白喉毒素、銅綠假單胞菌外毒素A、產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素、志賀毒素等細菌外毒素由于其活性部位能夠特異性地抑制細胞某種功能而導(dǎo)致細胞程序性死亡，因而被作為腫瘤治療的新方法獲得廣泛研究[1-4]。志賀毒素是由痢疾志賀菌和腸出血性大腸埃希菌產(chǎn)生的蛋白毒素，具有細胞毒性、腸毒素毒性和神經(jīng)毒性3 種生物學(xué)活性[5-7]，分為I 型志賀毒素（Stx1）和II 型志賀毒素（Stx2），兩者基因同源性約為56%[7]。其中，Stx1 由1 個A 亞基和5 個B 亞基組成，兩部分通過非共價作用結(jié)合。5 個B 亞基形成的孔環(huán)結(jié)構(gòu)通過與細胞表面特異性糖脂受體三己糖神經(jīng)酰體Gb3 結(jié)合，將A 亞基運輸至靶細胞的胞漿中[5,8-9]。Stx1 的A 亞基（Stx1A）由315 個氨基酸組成，分子量為32 kDa，具有高度特異的RNA N-糖苷酶活性，通過催化28S rRNA 的第4 324 位的腺苷脫嘌呤，使延伸因子1 依賴性的氨酰-tRNA 與核糖體的結(jié)合受到抑制，從而阻斷了肽鏈延伸和蛋白質(zhì)合成，引起細胞損傷[6]。已有實驗證明，Stx1A 靜脈或腹腔注射小鼠的半數(shù)致死量（LD50）僅為400 ng[10-11]，對上皮的人腎腺癌細胞LD50 僅為1 pg/mL[12]。Stx1A強大的細胞毒性功能，使其成為腫瘤治療研究和發(fā)展的新熱點。

然而，由于Stx1A 自身的細胞毒性作用沒有靶向性，同時作為分子量大于5 kDa 的多肽物質(zhì)具有不穩(wěn)定易降解、不易被細胞攝取等缺點，其開發(fā)與應(yīng)用受到嚴重制約[13-14]。因此，研發(fā)有效的載體系統(tǒng)靶向遞送Stx1A，使其免于體內(nèi)外不穩(wěn)定性、免疫原性和半衰期短的影響，同時提高Stx1A 胞內(nèi)的有效轉(zhuǎn)運，對于拓寬這類細菌蛋白毒素在腫瘤治療中的應(yīng)用有著重要意義。

腫瘤微環(huán)境靜脈回流緩慢且淋巴清除率差，這使得分子量大于40 kDa 的大分子物質(zhì)更容易滲透進入腫瘤組織并長期滯留，被稱為增強滲透滯留（Enhanced Permeability and Retention，EPR）效應(yīng)[15]。聚合物膠束的納米級粒徑可以避免巨噬細胞識別和吞噬，使其能通過腫瘤組織的EPR 效應(yīng)增強被動靶向性，減少藥物不良反應(yīng)，被認為是最有前景的抗腫瘤藥物遞送系統(tǒng)之一[16]。降低聚合物膠束在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的藥物釋放、提高膠束在腫瘤部位的蓄積和實現(xiàn)膠束在腫瘤細胞內(nèi)的快速釋藥是聚合物膠束遞送系統(tǒng)亟待解決的關(guān)鍵問題。大量研究表明，pH 響應(yīng)型聚合物膠束因具有智能的酸敏釋藥性而很好地解決了上述問題。pH 敏感型聚合物膠束在體內(nèi)的運輸不斷經(jīng)歷pH 值由高到低的梯度變化[17]：當外部環(huán)境如人體循環(huán)系統(tǒng)和正常組織pH 值（約為7.4）高于聚合物膠束嵌段聚合物的平衡解離常數(shù)時，聚合物膠束以緊密完整的形態(tài)包載藥物，基本不釋放，并通過EPR 效應(yīng)將藥物高濃度蓄積于腫瘤組織；當外部環(huán)境如腫瘤微環(huán)境的pH 值（6.5～7.2）接近聚合物膠束嵌段聚合物的平衡解離常數(shù)時，膠束略有膨脹松動，但是藥物仍包載在膠束的疏水核中。當外部環(huán)境如細胞內(nèi)吞體pH 值（5.0～6.0）低于聚合物膠束的嵌段聚合物的平衡解離常數(shù)時，膠束開始解聚并快速釋放藥物。因此pH 敏感型聚合物膠束有望完成腫瘤細胞內(nèi)的藥物遞送、釋放，實現(xiàn)癌癥的靶向治療。

本課題組在前期研究工作中設(shè)計合成、制備了pH 敏感型納米膠束PEG8-PDPA100-PEG8（其中PEG為聚乙二醇，PDPA 為聚異丙基甲基烯酸酯）可以有效地將小分子藥物DOX、核酸藥物HER2 和生物大分子轉(zhuǎn)鐵蛋白（分子量為7.7 kDa）完整遞送和釋放至腫瘤細胞并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[18-19]。實驗已證明，聚合物膠束具有高效的生物大分子包載率、良好的生物相容性和精準的pH 響應(yīng)性。在此基礎(chǔ)上，本文通過制備和驗證pH 敏感型聚合物膠束對Stx1A 的轉(zhuǎn)染率及誘導(dǎo)細胞發(fā)生程序性死亡的效率，考察Stx1A 在體外對腫瘤細胞Hela 的毒性作用，為細菌蛋白毒素在腫瘤治療中的應(yīng)用研究及pH 響應(yīng)型納米載體的深入研究提供有力的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

四氫呋喃（THF，分析純，上海泰坦試劑有限公司，使用前重蒸除水）；細胞毒性試劑盒（CCK-8, 日本DOJINDO 公司）；無血清培養(yǎng)基(DMEM, 美國Gibco 公司)；熱滅活胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司）；BeaverBeadsTMHis-tag 蛋白純化試劑盒（蘇州海貍公司）；膜聯(lián)蛋白V-PI 凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI，美國SAB 公司）；FITC 熒光標記試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）；兔網(wǎng)織紅細胞裂解液系統(tǒng)（Rabbit Reticulocyte Lysate System，美國Promega公司）。

1.2 測試與表征

動態(tài)光散射儀（Zetasizer Nano ZS90 型，英國馬爾文公司）；熒光顯微鏡（EVOS FL 型，美國AMG 公司）；流式細胞儀（FACS Calibur 型，美國BD Biosceiences 公司）；超聲波信號發(fā)生器（上海比朗公司）；透射電子顯微鏡（JEM-1400 型，日本電子株式會社）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 蛋白的表達

（1） 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 野生型stx1A 編碼序列（長度）和突變型Mu-stx1A 編碼序列由上海楚豫生物有限公司合成。Mu-Stx1A 編碼序列是通過對Stx1A氨基酸序列中的活性位點進行點突變，將第167 位谷氨酸突變?yōu)樘於彼?，作為本研究的陰性對照[20]。分別將stx1A 和Mu-stx1A 編碼序列插入載體pET28aXbal 和XhoI 位點構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-28a-stx1A 和pET-28a-Mu-stx1A。用熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，并接種于卡那抗性的LB（Luria-Bertani）平板（含硫酸卡那霉素50 μg/ mL），37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆接種到5 mL 含有50 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、250 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)6 h。小抽后，取2 μL 質(zhì)粒進行Xbal 和XhoI雙酶切電泳鑒定和測序分析。

（2） 野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 重組蛋白表達 將構(gòu)建好的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞Rosettagami(DE3)，利用卡那抗性LB 平板篩選陽性克隆。挑選陽性克隆接種至5 mL 含有50 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將上述菌液全部接種于150 mL 含有50 μg/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至吸光度（OD600）達到0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），在16 ℃誘導(dǎo)過夜，然后在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心25 min，收集菌體沉淀進行蛋白純化。

（3） 野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 重組蛋白的分離純化 用BeaverBeadsTMHis-tag Protein Purification 試劑盒純化蛋白。將2 g 菌液沉淀用10 mL 結(jié)合液（40 mmol/L 咪唑的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液）重懸，加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）（1 mmol/L），置于冰上超聲裂解細菌（超聲參數(shù)：功率300 W，超聲3 s，間隔6 s，總時間30 min）。將超聲破碎后的菌液加入預(yù)處理后的5 mL 鎳離子螯合磁珠（150～250 μmol/L）中混合均勻，然后在4 ℃旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)孵育1 h 使目標蛋白結(jié)合在磁珠上。對磁珠和菌液進行磁性分離，用洗液洗滌磁珠2 次，加入洗脫液洗脫目標蛋白。將空載體、未誘導(dǎo)菌液、誘導(dǎo)后菌液、洗脫液進行SDS-PAGE，檢測蛋白表達和蛋白純度。

（4） 野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 的活性測定

熒光素酶（Luciferase）的熒光標準曲線：用1 mg/mL的BSA 緩沖液稀釋配制4.3×10-10～4.3×10-19mol/L 的熒光素酶溶液，以熒光素為底物，用化學(xué)發(fā)光儀檢測熒光素酶在催化熒光素氧化過程所產(chǎn)生的生物熒光，以熒光素酶的物質(zhì)的量為橫坐標，熒光強度為縱坐標，做熒光標準曲線。

用兔網(wǎng)織紅細胞裂解液（含有蛋白質(zhì)合成所必需的tRNA、核糖體、起始延伸和終止因子等組分）體外轉(zhuǎn)錄試劑盒檢測野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A蛋白對熒光素酶蛋白合成過程的影響。在冰浴上用預(yù)冷PBS 溶液將野生型蛋白和突變型蛋白分別稀釋成不同的濃度，分別取1.5 μL 蛋白溶液與17.5 μL 的兔網(wǎng)織紅細胞裂解液在37 ℃下反應(yīng)60 min，以不加蛋白的兔網(wǎng)織紅細胞裂解液在37 ℃下反應(yīng)60 min作為陽性對照。再分別加入0.25 μL 氨基酸混合物（無亮氨酸，1 mmol/L)、0.25 μL 氨基酸混合物（無蛋氨酸，1 mmol/L)、0.5 μL RNasin?核糖核酸酶抑制劑(40 ug/μL)、2 μL 熒光素酶對照RNA (1 μg/μL)和5.5 μL 無核酸酶水。然后在30 ℃下培養(yǎng)90 min，加入熒光素底物，測定熒光強度，根據(jù)熒光素酶熒光標準曲線計算相應(yīng)的熒光素酶的含量，從而反映出野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 對熒光素酶合成過程的影響。

（5） 野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 的熒光標記

將370 μg 異硫氰酸熒光素酯（ FITC，MW=389.5）染料標記試劑溶解在37 μL 的二甲基亞砜（DMSO）中，使FITC 與蛋白的物質(zhì)的量之比為40∶1，取適量的FITC 與0.2 mg/mL 的野生型或突變型蛋白混合，避光條件下攪拌反應(yīng)60 min，用FluoReporter?蛋白標記試劑盒中配備的Spin 柱和純化樹脂除去非特異性連接的染料分子，從而得到FITC 標記的野生型或突變型蛋白。

1.3.2 聚合物膠束包載Stx1A 或Mu-Stx1A 用課題組合成的PEG8-PDPA100-PEG8制備膠束包載蛋白。取0.2 mg/mL 的蛋白200 μL 加入0.8 mL、pH 為7.4 的PBS 緩沖液中，然后逐滴滴入棕色小瓶中（瓶內(nèi)裝有50 μL、6 mg/mLPEG8-PDPA100-PEG8的四氫呋喃溶液），攪拌過夜，使四氫呋喃揮發(fā)完全。最終棕色小瓶內(nèi)的蛋白質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL，聚合物質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL。使用動態(tài)光散射儀檢測空膠束及載蛋白膠束的粒徑分布及表面電位；將一定量的空膠束、游離蛋白及載蛋白膠束分別負載在銅網(wǎng)上，用透射電子顯微鏡觀察形貌。

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染率測定 細胞轉(zhuǎn)染率：將Hela 細胞（ATCC）在體積分數(shù)為10%牛血清蛋白（FBS） DMEM雙抗培養(yǎng)基（含100 U/mL 青霉素G/硫酸鏈霉素）中貼壁培養(yǎng)至細胞密度達到80%，然后接種于含新鮮培養(yǎng)基的12 孔板（5×105個/孔）中繼續(xù)培養(yǎng)過夜。當孔板中細胞密度達到80%時，用熒光標記的不同濃度的Stx1A 膠束、Mu-Stx1A 膠束以及空膠束將其分別轉(zhuǎn)染2 h，用PBS 洗滌，將細胞重懸于培養(yǎng)液中，用流式細胞儀分析細胞轉(zhuǎn)染率。

1.3.4 細胞凋亡測定 用Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率：首先將Hela 細胞接種在6 孔板中，培養(yǎng)過夜；然后分別與空膠束、Stx1A 膠束和Mu-Stx1A 膠束（其中Stx1A 和Mu-Stx1A 的質(zhì)量均為4 μg）共孵育2 h，用PBS 洗3 遍，將細胞重懸于結(jié)合緩沖液中與annexin V-FITC 和碘化吡啶（PI）于室溫下共孵育10 min，用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

2 結(jié)果與討論

2.1 pET-28a-stx1A 和pET-28a-Mu-stx1A 的 質(zhì) 粒鑒定

stx1A 編碼序列插入質(zhì)粒pET-28a 的XbaI 和XhoI 單克隆位點之間。用XbaI 和XhoI 分別雙酶切pET-28a-stx1A 和pET-28a-Mu-stx1A。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1（a））顯示，酶切產(chǎn)物長度約為900 bp。將酶切鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送測序分析，測序結(jié)果和雙酶切結(jié)果均證明pET-28a-stx1A 和pET-28a-Mu-stx1A 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 重組蛋白表達與鑒定

分別將空載體和未誘導(dǎo)Stx1A 或Mu-Stx1A 菌液、誘導(dǎo)后Stx1A 或Mu-Stx1A 菌液、純化后洗脫下來的Stx1A 或Mu-Stx1A 重組蛋白溶液進行SDSPAGE 和考馬斯亮藍染色。從圖1（b）SDS-PAGE 圖中可以看出，在32 kDa 左右出現(xiàn)條帶，表明野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 重組蛋白成功表達。

圖1 Xbal 和XhoI 雙酶切電泳（a）和Stx1A 重組蛋白，Mu-Stx1A 重組蛋白的SDS-PAGE（b）Fig. 1 pET-28a-Stx1A digested with Xbal and XhoI (a) and SDS-PAGE of Stx1A and Mu-Stx1A recombinant protein (b)

2.3 野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 對蛋白合成的抑制作用

首先考察了Stx1A 和Mu-Stx1A 對蛋白合成的抑制功能。用兔網(wǎng)織紅細胞裂解液體外轉(zhuǎn)錄翻譯試劑盒檢測Stx1A 和Mu-Stx1A 對熒光素酶轉(zhuǎn)錄與翻譯過程的影響，判斷Stx1A 和Mu-Stx1A 的生物活性。從圖2 的結(jié)果可以看出，當野生型Stx1A 質(zhì)量濃度在10～40 μg/mL 時，熒光素酶合成量出現(xiàn)驟然的下降，從100%降至約10%，表明野生型Stx1A 具有抑制蛋白合成的功能；當野生型Stx1A 質(zhì)量濃度高于40 μg/mL 時，熒光素酶合成量繼續(xù)減少，直至幾乎完全抑制體外蛋白的合成，表明野生型Stx1A 具有抑制蛋白合成的功能，有較高的生物活性。相反，突變型Mu-Stx1A 在1.25～40 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對熒光素酶合成量幾乎沒有抑制作用；當其質(zhì)量濃度高于40 μg/mL 時，熒光素酶合成量仍在80%以上，表明突變型Mu-Stx1A 不具有抑制蛋白合成的功能。因此突變型Mu-Stx1A 可作為本實驗的陰性對照。在本實驗中野生型Stx1A 和突變型Mu-Stx1A 的質(zhì)量濃度均選擇40 μg/mL，在該濃度下，野生型Stx1A 能夠抑制90%的體外蛋白合成量，而突變型Mu-Stx1A幾乎不具有抑制體外蛋白合成的作用。這是由于野生型Stx1A 蛋白具有高度特異的RNA N-糖苷酶活性，催化28S rRNA 上的腺苷脫嘌呤，使延伸因子1 依賴性的氨酰-tRNA 與核糖體的結(jié)合受到抑制，從而阻斷了肽鏈延伸和蛋白質(zhì)合成；而突變型Mu-Stx1A 氨基酸序列是通過對Stx1A 氨基酸序列中的活性位點進行點突變，使得重組表達的突變型Mu-Stx1A 蛋白不再具有蛋白抑制作用。

圖2 Stx1A 和Mu-Stx1A 對蛋白的合成抑制作用Fig. 2 Inhibition of protein synthesis by Stx1A and Mu-Stx1A

2.4 包載蛋白的聚合物膠束物理化學(xué)性質(zhì)

實驗測試了PEG8-PDPA100-PEG8空膠束及其包載Stx1A 和Mu-Stx1A 前后的理化性質(zhì)。表1 所示是通過動態(tài)光散射儀檢測膠束和蛋白的性質(zhì)與參數(shù)，空膠束的粒徑為173.4 nm，在包載Stx1A 或Mu-Stx1A 后，膠束粒徑變?yōu)?89.0 nm 和208.5 nm。與空膠束粒徑相比，在包載蛋白后含蛋白膠束的粒徑有所增大，且形成Stx1A 膠束和Mu-Stx1A 膠束的聚合物分散系數(shù)（PDI）值較小，說明形成的聚合物膠束粒徑均一。同時，在pH 為7.4 時，Stx1A 和Mu-Stx1A 蛋白的電位分別為-11.0 mV 和-12.4 mV，空膠束的電位為-8.8 mV，在包載Stx1A 或Mu-Stx1A 后，膠束電位分別變?yōu)?12.2 mV和-14.9 mV。實驗結(jié)果顯示空膠束和包載蛋白的膠束都呈電負性。圖3 示出了通過TEM 表征空膠束及其包載蛋白后的形貌，空膠束的粒徑為130 nm左右，游離蛋白的粒徑在40～60 nm之間，包載蛋白的膠束粒徑在150 nm 左右，這主要是因為動態(tài)光散射儀檢測時膠束處于水化狀態(tài)因而粒徑會比TEM 結(jié)果略大。同時，聚合物膠束在包載蛋白后其粒徑略有增加，這與動態(tài)光散射儀測定結(jié)果一致。通常情況下，蛋白表面存在親水區(qū)域和疏水區(qū)域[21]，因此可以推測本文所用的聚合物可能是蛋白表面的疏水區(qū)域通過疏水相互作用把蛋白載入到膠束中。

圖3 空膠束（a）、蛋白（b）及載蛋白膠束（c）的TEM 圖Fig. 3 TEM images of unloaded micelles (a), free protein (b) and protein-loaded micelles (c)

表1 膠束及蛋白的性質(zhì)和參數(shù)Table 1 Properties and parameters of micelle and free protein

2.5 聚合物膠束包載對蛋白的細胞轉(zhuǎn)染率的影響

為了考察聚合物膠束的包載對蛋白的細胞轉(zhuǎn)染率的影響，本文用聚合物膠束包載FITC 標記的野生型或突變型蛋白并轉(zhuǎn)染Hela 細胞，用流式細胞儀測定細胞轉(zhuǎn)染率，結(jié)果如圖4 所示。研究表明，未包載的 Stx1A 和 Mu-Stx1A 細胞幾乎不能被細胞攝?。ㄞD(zhuǎn)染率分別為0.518%（圖4（a））和0.417%（圖4（d））），主要是因為蛋白質(zhì)多肽類生物大分子自身很難穿過細胞膜的磷脂雙分子層而進入細胞內(nèi)部[22]。而聚合物膠束包載的Stx1A 膠束（4 μg）、Stx1A 膠束（6 μg）的細胞轉(zhuǎn)染率分別為20.1%（圖4（b））和59.4%（圖4（c）），相應(yīng)地，Mu-Stx1A 膠束（4 μg）、Mu-Stx1A 膠束（6 μg）的細胞轉(zhuǎn)染率分別為22.7%（圖4（e））和39.6%（圖4（f））。說明無論是野生型還是突變型蛋白，通過聚合物膠束包載運輸都能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白物質(zhì)的胞內(nèi)有效運輸而獲得較高的細胞轉(zhuǎn)染率，且當與Hela 細胞孵育的蛋白量從4 μg 增加到6 μg 時，細胞轉(zhuǎn)染率提高，表明該聚合物膠束具有將蛋白運載進入胞內(nèi)的能力。

圖4 FITC 標記的Stx1A 膠束和Mu-Stx1A 膠束的細胞轉(zhuǎn)染率Fig. 4 Cell transfection efficiency of FITC-labeled Stx1A and Mu-Stx1A micelles

本文所用的pH 敏感型聚合物膠束在我們課題組之前的研究中[19]已經(jīng)驗證了其能夠通過內(nèi)吞作用進入細胞的溶酶體中。通過測定發(fā)現(xiàn)聚合物膠束的pH 敏感點在6.9 左右，而在癌細胞中內(nèi)體的pH 值為5.0～6.0。因此當膠束進入內(nèi)體時，PDPA（聚異丙基甲基烯酸酯）發(fā)生質(zhì)子化膠束溶脹解體釋放蛋白質(zhì)，同時由于膠束“質(zhì)子海綿”效應(yīng)的滲透裂解和膠束溶脹產(chǎn)生的機械應(yīng)變會導(dǎo)致內(nèi)體破裂[23]，將目標蛋白釋放到胞漿中。

2.6 聚合物膠束包載蛋白對細胞毒性的影響

為了測定聚合物膠束包載的Stx1A（Stx1A 膠束）對Hela 細胞的細胞毒性，選用膠束包載的突變型Mu-Stx1A（Mu-Stx1A 膠束）作為陰性對照。不同質(zhì)量的Stx1A 膠束或者Mu-Stx1A 膠束與Hela 細胞共孵育2 h 后，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并用Annexin VFITC/PI 細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率，實驗結(jié)果如圖5 所示。從圖5（a）可以看到在相同的蛋白量下，與Mu-Stx1A 膠束共孵育后的細胞相比，Stx1A 膠束作用后的Hela 細胞濃縮變圓，失去黏附能力。且隨包載的Stx1A 質(zhì)量的增加，細胞病變效應(yīng)越明顯（圖5（a～c））。相應(yīng)地，Mu-Stx1A 膠束作用后的細胞即使在較高的Mu-Stx1A 質(zhì)量（8 μg）下細胞也正常，貼壁生長良好，呈菱形或不規(guī)則的三角形（圖5（d～f））。用流式細胞儀分析Stx1A 膠束或Mu-Stx1A 膠束（4 μg）對Hela 細胞的凋亡率的影響，發(fā)現(xiàn)與未包載Stx1A 或未包載Mu-Stx1A 共孵育后，細胞凋亡率分別為5.90%和7.78%（圖6（a、c）），而與Stx1A 膠束或Mu-Stx1A 膠束（4 μg）作用后，Hela 細胞凋亡率分別為35.5%和5.22%（圖6（b、d）），該數(shù)據(jù)和圖5 觀察到的細胞形態(tài)結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，聚合物膠束包載的Stx1A 進入細胞后仍然具有生物活性，能夠抑制蛋白合成導(dǎo)致細胞凋亡，而作為對照的Mu-Stx1A 膠束由于其本身沒有相應(yīng)的生物功能因而細胞毒性極小。

圖5 Hela 細胞與不同質(zhì)量的Stx1A micelle 和Mu-Stx1A micelle 作用后的細胞形態(tài)Fig. 5 Apoptosis of Hela cells after treated with Stx1A micelle or Mu-Stx1A micelle with different mass

圖6 Hela 細胞與不同濃度的 Stx1A micelle 或 Mu-Stx1A micelle 作用后的凋亡實驗Fig. 6 Apoptosis experiment of Hela cells after treated with Stx1A micelle or Mu-Stx1A micelle with different concentrations

3 結(jié)束語

利用pH 敏感型三嵌段聚合物PEG8-PDPA100-PEG8與志賀毒素蛋白Stx1A 自組裝形成蛋白-聚合物膠束，這種pH 敏感型膠束在正常體液環(huán)境下不溶脹，轉(zhuǎn)染進入細胞后，由于內(nèi)體中pH 低，PDPA 的質(zhì)子化速率快，使得膠束迅速溶脹解體將Stx1A 釋放至腫瘤細胞漿中，Stx1A 具有抑制蛋白合成的作用，其在胞漿中發(fā)揮毒性功能，誘導(dǎo)細胞程序性死亡。

該聚合物膠束具有細胞毒性低、制備簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可以作為蛋白類、核酸類等生物大分子細胞轉(zhuǎn)染的選擇。本研究為腫瘤細胞靶向遞送功能性生物大分子提供了一種有效方法，并為后續(xù)Stx1A 在腫瘤治療中的研究和應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。