高永鋼

摘要 利用水稻 ROXY1、ROXY2基因序列，在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢索，發(fā)現(xiàn) GRMZM2G442791基因（ MS22）序列與 ROXY1、 ROXY2之間具有較高的相似度（73%～79%）。以玉米 B73自交系為實(shí)驗(yàn)材料克隆 MS22啟動(dòng)子區(qū)序列;用生物信息學(xué)方法對(duì)水稻 ROXY1、 ROXY2及 MS22基因核苷酸序列以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、親水性和疏水性及進(jìn)化樹等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，玉米雄性核不育相關(guān)基因 MS22編碼區(qū)長(zhǎng)度為480 bp，編碼159個(gè)氨基酸; ROY1編碼區(qū)長(zhǎng)度為 408 bp，編碼136個(gè)氨基酸; ROXY2編碼區(qū)長(zhǎng)度為420 bp，編碼140個(gè)氨基酸。通過對(duì)蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)， MS22、 ROXY1、 ROXY2都為谷氧還蛋白家族成員，具有 GRX 家族基因相似的功能結(jié)構(gòu)域和近似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此推測(cè)， MS22可能與 ROXY1、 ROXY2具有相似的功能，可能參與氧化還原調(diào)節(jié)、植物脅迫防御，在控制雄性配子發(fā)生中起主要調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞 玉米;雄性不育; MS22基因;生物信息

中圖分類號(hào) S513???? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A????? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.03.009

Cloning of Maize Genic Male Sterility Gene MS22 and Bioinformatics Analysis of Its Homologous Gene

GAO Yonggang1，2

（1. Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou， Inner Mongolia 014010， China;2. College of Energy and Envi-ronment， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou， Inner Mongolia 014010， China）

Abstract? Using rice ROXY1 and ROXY2 gene sequences， a homology search was conducted in the maize genome database. the searching results showed that the GRMZM2G442791（MS22） gene sequence had a high degree of similarity with ROXY1 and ROXY2（73%-79%）. Primers were designed by using Primer5.0， and MS22 was cloned by using the maize B73 inbred line. Bioinformatics methods were used to analyze the nucleotide sequences， protein structure， hydrophilia， hydrophobicity and evolution tree of rice ROXY1， ROXY2 and MS22. The results showed that the coding regions of the maize male sterility related gene MS22， ROY1 and ROXY2 are 480 bp， 408 bp and 420 bp in length， respectively and encode 159 amino acids， 136 amino acids and 140 amino acids， respectively. The analysis of protein functions and domains showed that MS22， ROXY1 and ROXY2 are members of the glutaredoxin （GRX） family and have the similar functional domains and similar tertiary structure to GRX family genes. Therefore， it is speculated that MS22 may have similar functions to ROXY1 and ROXY2， could participate in redox regulation， plant stress defense， and play a major role in controlling male gametogenesis.

Keywords? maize; male sterility; MS22; bioinformatics

玉米是我國(guó)最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量的提高主要依賴于雜種優(yōu)勢(shì)的利用。玉米核雄性不育（ Genic male sterility）是由細(xì)胞核基因突變導(dǎo)致的雄性敗育現(xiàn)象，表現(xiàn)為植物有性生殖過程中不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子而雌蕊功能正常的遺傳現(xiàn)象[1]。玉米雄性不育基因的克隆不僅有助于解析玉米花藥發(fā)育的分子機(jī)理，同時(shí)也為玉米雜交種的生產(chǎn)提供理論支撐。玉米目前是國(guó)際上第一大糧食作物，玉米商業(yè)雜交種質(zhì)量直接影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在抗病性、育性遺傳等方面存在諸多不確定性和干擾因素。近些年有關(guān)學(xué)者將目光再次集中于受環(huán)境影響較小、遺傳較為穩(wěn)定且持續(xù)的細(xì)胞核雄性不育[2-4]。

迄今，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200多個(gè)玉米雄性不育突變體，大部分為隱性核不育突變體，其中，部分完成了染色體的初步定位和細(xì)胞學(xué)分析，僅有少數(shù)基因完成了分離克隆。目前已經(jīng)克隆的玉米隱性核不育基因有12個(gè)，包括 ms1、ms7、ms8、 ms9、 ms22/msca1、 ms23、 ms26、 ocl4、 mac1、 ms30、 ms32和 ms45[5-6]。

谷氧還蛋白（ GRX）是參與各種細(xì)胞過程的小型氧化還原酶，并在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。前人報(bào)道稱，2個(gè) CC 型 GRX 基因 ROXY1和 ROXY2一起控制擬南芥中的花藥發(fā)育[7]。 ROXY1和 ROXY2是 CC 型花谷氧還蛋白，在擬南芥花藥發(fā)育中具有調(diào)控功能。 ROXY1在高等植物中編碼谷氧還蛋白亞基，這類蛋白調(diào)節(jié)植物花器官發(fā)育， ROXY1蛋白中保守的谷胱甘肽結(jié)合甘氨酸的誘變，表明 CC 型 GRX 需要與谷胱甘肽相互作用以催化必要的生物合成反應(yīng)[8-9]。 roxy1和? roxy2的單突變體可育并產(chǎn)生正常的花藥;然而， roxy1、 roxy2雙突變體是不育的，不產(chǎn)生花粉。研究表明， ROXY1和 ROXY2在花藥發(fā)育過程中以復(fù)合模式表達(dá)， ROXY1和 ROXY2功能的缺乏在轉(zhuǎn)錄水平影響大量花藥基因，控制絨氈層發(fā)育。對(duì) ROXY1和 ROXY2的分析表明，該類基因可能參與氧化還原調(diào)節(jié)、植物脅迫防御，在控制雄性配子發(fā)生中起主要作用[10-11]。

本研究在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（ https ：//maizegdb.org/）中對(duì)水稻 ROXY1和 ROXY2基因序列進(jìn)行同源比對(duì)、檢索，獲得玉米 GRMZM2G442791基因序列;經(jīng)基因克隆、測(cè)序、序列分析后，運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)該基因及 ROXY1和 ROXY2進(jìn)行分析。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)所用材料為玉米 B73 自交系，由實(shí)驗(yàn)室盆栽種植，待玉米生長(zhǎng)至 V3時(shí)期，取幼嫩葉片提取基因組 DNA，用于 MS22基因的擴(kuò)增。

通過 NCBI 檢索 ROXY1和 ROXY2基因序列，在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源比對(duì)。利用expasy數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.expasy.org /tools / protparam.html）對(duì)基因的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能域進(jìn)行序列分析預(yù)測(cè)。通過InterPro（ http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）對(duì) ROXY1和 ROXY2全長(zhǎng) cDNA 序列編碼的氨基酸序列和玉米 MS22全長(zhǎng) cDNA 序列編碼的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。用 SOPMA（http：//npsa- pbil.ibcp.fr/cgi- bin/=/ NPSA/npsa_sopma.html ）對(duì) MS22、 ROXY1 和 ROXY2基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用Phyre（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre/）程序?qū)?MS22、 ROXY1和 ROXY2基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并利用Rasmol軟件對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖形化分析。用Clustal X 對(duì)蛋白質(zhì)多重序列進(jìn)行比對(duì)。利用 Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，取玉米新鮮幼嫩的葉片，采用 CTAB 法提取玉米基因組 DNA;利用 Power? pol 2×PCR Mix 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。膠回收試劑盒、大腸桿菌 DH5α、 DNA marker、 Simple -Blunt Peasy-T 載體等購(gòu)自上海生物工程股份有限公司。所用引物由上海生工負(fù)責(zé)合成（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米 MS22啟動(dòng)子克隆

玉米 MS22基因位于玉米第7 條染色體（ Chr7：5333364..5334245）短臂，通過 Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，提取 B73材料幼嫩葉片的 DNA，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1523 bp 的序列，見圖1。

通過對(duì)目的片段進(jìn)行凝膠回收及連接轉(zhuǎn)化，挑取單菌落經(jīng)菌落 PCR（圖2）鑒定正確后測(cè)序，對(duì)測(cè)序成功的序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2.2? ROXY1、ROXY2與 MS22基因功能結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

以 MS22、ROXY1、ROXY2的氨基酸序列為模板，在 NCBI 網(wǎng)站中對(duì)其進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)蛋白均屬于硫氧還蛋白超級(jí)家族，并具備該家族典型的保守結(jié)構(gòu)域及相關(guān)功能位點(diǎn)（圖3）。

利用expasy數(shù)據(jù)庫(kù) tools-protparam在線程序?qū)?MS22、 ROXY1、 ROXY2的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， MS22和 ROXY2為疏水性蛋白，其親水指數(shù)分別為0.496和0.474;而 ROXY1為親水蛋白，其親水系數(shù)為0.604，3個(gè)蛋白的具體理化性質(zhì)見表2。

2.3 蛋白序列及保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì) MS22、 ROXY1、 ROXY2進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)， MS22與 ROXY1、ROXY2在第50個(gè)氨基酸之后具有較高的匹配度。這一區(qū)段也正是 GSH 轉(zhuǎn)移酶（ GST， N 端結(jié)構(gòu)域）活性位點(diǎn)結(jié)合區(qū)段，該區(qū)段有谷氧還蛋白家族（ GRXs ）特有的結(jié)構(gòu)域，具有氧化還原活性 CXXC 的保守基序。

玉米的 MS22與其他植物的 GRX 類蛋白一樣具有谷氧還蛋白的特殊結(jié)構(gòu)域。玉米的 MS22基因?qū)儆诠妊踹€蛋白家族中Glutaredoxin–C9的成員。利用在線結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析軟件 MEME3.0對(duì)玉米的 MS22、ROXY1、ROXY2基因的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因均具有 GRX 類蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)域（圖4）。

利用在線網(wǎng)站 http：//meme-suite.org/分析 Glutaredoxin-C9-like 蛋白的保守基序，在氨基酸序列的第49～97的位點(diǎn)處有一個(gè)含有49個(gè)氨基酸殘基的保守基序 motif。分析發(fā)現(xiàn)，該類蛋白的氨基酸序列包含 GRX 基因家族特有的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域： CY LV C 或者 CMR K S 的保守基序，CXXC 與 CXXS 為該類群蛋白質(zhì)的特征標(biāo)志（圖5）。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，玉米 MS22屬于谷氧還蛋白亞類 III，結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有 GRX-subIII的CCx[C/S/GI]典型活性位點(diǎn)。

2.4? MS22及同源基因的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用在線分析軟件 Swiss-Model （ http ：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)玉米 MS22基因的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。 MS22蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸結(jié)構(gòu)為主。如圖6所示， a-螺旋為藍(lán)色，不規(guī)則卷曲為黃色，延伸鏈結(jié)構(gòu)為紅色，β-轉(zhuǎn)角為綠色，玉米 MS22蛋白的三維結(jié)構(gòu)組成以α-螺旋、不規(guī)則卷曲、延伸結(jié)構(gòu)為主。應(yīng)用 SOPMA 軟件預(yù)測(cè) MS22蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋占38.12%、β-轉(zhuǎn)角占14.37%、延伸鏈占21.25%、無規(guī)卷曲占26.25%。

利用Ensembl? Genomes 網(wǎng)站（http：//ense- mblgenomes.org/）檢索玉米的 zm00001d018802。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米 MS22有37個(gè)直系同源物種基因和19個(gè)旁系同源物種基因（圖7）。主要包括的農(nóng)作物有小麥、大麥、水稻、大豆、高粱、谷子等，此外還有苜蓿、卷柏、樟子松、葡萄等。分析發(fā)現(xiàn)，這類基因主要存在于陸生禾本科開花植物中，在植物中主要對(duì)電子載體活性及蛋白質(zhì)二硫氧化還原酶活性起調(diào)控作用。

3 討論與結(jié)論

GRXs 蛋白是一類小分子氧化還原酶，是一類約包含 100個(gè)氨基酸殘基及氧化還原活性 CXXC 結(jié)構(gòu)的小分子蛋白;該類蛋白主要在植物中調(diào)節(jié)氧化還原代謝反應(yīng)及相關(guān)通路信號(hào)的識(shí)別;該類基因在擬南芥、水稻、高粱、玉米、谷子及一些花卉植物、蔬菜中以不同的作用形式存在[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米 MS22、水稻 ROXY1、 ROXY2蛋白均屬于硫氧還蛋白超級(jí)家族中谷氧還蛋白家族（ GRXs）成員，該類蛋白目前已經(jīng)被證實(shí)參與植物不同的細(xì)胞代謝過程，例如植物的氧化脅迫、干旱、鹽害、高溫、冷害、重金屬等抗性，植物個(gè)體對(duì)一些真菌類病原菌的抗性水平方面[16-18]。

本研究對(duì)水稻 ROXY1、ROXY2及玉米 MS22 的 DNA 序列、氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)， MS22、 ROXY1、ROXY2具有較高的序列相似性，其在基因結(jié)構(gòu)、保守基序、功能結(jié)構(gòu)域上都具有 GRXs 蛋白家族典型的基因結(jié)構(gòu)。說明 MS22在植物中不僅可導(dǎo)致玉米雄性不育發(fā)生，而且在不同植物、不同生育時(shí)期，其功能類似于同為禾本科作物水稻 ROXY1和 ROXY2等其他 GRXs 類蛋白家族成員，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)、抵御不同生物（非生物）逆境環(huán)境脅迫條件，參與植物不同器官的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過程。本研究對(duì)玉米雄性核不育基因 MS22有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，對(duì)其他作物中該類型基因的研究具有一定的理論參考價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 林海妹）