劉芳芳 燕 平 王 平 張 耀 武麗萍 李 娟 張 贊 郭曉峰 陶功定 李俊蓮*

1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030619；2.山西省中醫(yī)院，山西 太原 030001

隨著人們生活方式的改變，肥胖成為了全球日益嚴(yán)重的問(wèn)題。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)2015年全球成人已有23億達(dá)到超重，7億人口達(dá)到了肥胖標(biāo)準(zhǔn)[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肥胖形成的原因主要與過(guò)食肥甘厚味，內(nèi)傷脾胃，濕從內(nèi)生有關(guān)?！端貑?wèn)·奇病論》曰:“必?cái)?shù)食甘美而肥也?！薄端貑?wèn)·通評(píng)虛實(shí)論》指出：“肥貴人，則膏粱之疾也?！眴渭冃苑逝职Y是現(xiàn)代社會(huì)中最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)障礙性疾病，對(duì)于單純性肥胖的中醫(yī)證型可分為脾虛濕阻型、肝郁氣滯型、陰虛內(nèi)熱型等多種[2]。目前臨床最為常見(jiàn)的是脾虛濕阻型單純性肥胖。本研究采用高脂飼料造成大鼠單純性肥胖模型，通過(guò)觀察記錄單純性肥胖大鼠一般情況、血清血脂、免疫指數(shù)的變化,探討脾虛型單純性肥胖模型大鼠體質(zhì)量、宏觀癥候、血清生化指標(biāo)、免疫指數(shù)等的影響。為建立脾虛濕阻型單純性肥胖模型提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 種類：雄性Spargue-Dawley(SD),成年健康大鼠40只,SPF級(jí),體質(zhì)量(200±20)g。來(lái)源：中國(guó)維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。血生化分析儀BECKMAN COULTER AU5800；電子天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司；低速離心機(jī)：鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 藥物及試劑 含60% kcal%脂肪的高脂飼料。蛋白質(zhì)：26.2 gm%；20 kcal%碳水化合物：26.3 gm%；脂肪：34.9 gm%。 40 kcal%型號(hào)：D12492蛋白質(zhì)，購(gòu)于中國(guó)維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒 (蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許2001-0367)；低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒(蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許2001-0367)；甘油三酯測(cè)定試劑盒(GPO-POD法)(蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許2001-0367)；總膽固醇測(cè)定試劑盒(酶法)(蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許2001-0367)；FITC偶聯(lián)抗大鼠的抗原CD3+抗體購(gòu)于比歐聯(lián)科供應(yīng)鏈管理(北京)有限公司，貨號(hào):8051814；APC偶聯(lián)抗大鼠的抗原CD4+抗體購(gòu)于比歐聯(lián)科供應(yīng)鏈管理(北京)有限公司，貨號(hào):8108554；PE偶聯(lián)抗大鼠的抗原CD8+抗體購(gòu)于比歐聯(lián)科供應(yīng)鏈管理(北京)有限公司，貨號(hào):8116845。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制作 單純性肥胖模型制作文獻(xiàn)[3]，雄性SD大鼠40只,重量為(200±20)g,4～6周齡，每籠5只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組10只(普通飼料喂養(yǎng))與單純性肥胖模型組30只(高脂飼料喂養(yǎng))。高脂飼料喂養(yǎng)8周后，大鼠體重超過(guò)普通飼料喂養(yǎng)大鼠體重 20%作為實(shí)驗(yàn)性營(yíng)養(yǎng)肥胖大鼠，設(shè)為單純性肥胖大鼠組。

2.2 觀察項(xiàng)目 于造模前、后每日上午9：00定時(shí)稱量大鼠的體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量,并記錄。每日觀察記錄每組大鼠的精神狀況、活動(dòng)情況、毛色光澤度、皮膚黏膜及排泄物性狀,對(duì)宏觀癥候評(píng)定計(jì)分。

將鑒定為造模成功的大鼠腹主動(dòng)脈取血，裝入離心管中，離心機(jī)離心，取上清液，倒入尖管內(nèi)。血清、血脂四項(xiàng)生化分析。取脾組織，脾組織流式細(xì)胞檢測(cè)。

2.3 兩組大鼠免疫指標(biāo)(脾細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+含量) 操作步驟：①取兩組大鼠脾臟，每組大鼠脾臟分別放置在5 mL無(wú)菌小燒杯中，先用無(wú)菌的玻璃注射器內(nèi)塞輕輕研磨脾組織，研磨至脾組織成糊狀，加入適量無(wú)菌PBS液后，用無(wú)菌吸管反復(fù)進(jìn)行吹打至均勻，使用漏斗將脾細(xì)胞混懸液在200目篩網(wǎng)中過(guò)濾后，進(jìn)入10 mL無(wú)菌離心管中，將離心管平衡放入離心機(jī)中以1000 r/min，離心5 min；②倒掉上清液，分別加入CD3+、CD4+、CD8+抗體各10 μL混合液，4 ℃避光孵育20 min，行表面染色； ③配制工作液Ⅰ(洗滌液)：20次test[5X Perm/wash Buffer∶雙蒸水=1∶4]使用前先搖晃原液；④在兩組大鼠脾細(xì)胞1 mL混懸液中，分別加入2 mL工作液Ⅰ，1000 r/min,離心5 min；⑤配制工作液Ⅱ(破膜劑)：20次test[4X Fix/perm∶TF Diluent Buffer=1∶3]使用前請(qǐng)搖晃原液；⑥倒掉上清液，觀察細(xì)胞裂解程度，如有離心管內(nèi)有絮狀物，則分別加入1 mL工作液Ⅱ混勻，4 ℃下避光孵育5 min；⑦分別加洗滌液1 mL，搖勻，1000 r/min，離心5 min，重復(fù)1次；⑧分別加入2 mL PBS洗滌液，震蕩混勻，1000 r/min，離心5 min,重復(fù)1次。加入200 ulPBS洗滌液;⑨分別加入2 mL流式染色緩沖液重懸細(xì)胞。將兩組細(xì)胞上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，CELLQuest下獲取信號(hào)并分析。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)大鼠實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量的比較 本實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只、單純性肥胖模型組30只,兩組間動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前(適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后)體質(zhì)量的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體質(zhì)量的比較

3.2 實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量的變化 造模前,兩組間實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 單純性肥胖模型造模2周后單純性肥胖模型組大鼠體質(zhì)量(351.77±20.56)較對(duì)照組(396.49±23.96)顯著升高(P<0.01)。單純性肥胖模型造模7周后單純性肥胖模型組大鼠體質(zhì)量(539.22±40.15)較對(duì)照組(593.11±55.52)顯著升高(P<0.01)。單純性肥胖模型造模8周后單純性肥胖模型組大鼠體質(zhì)量(606.85±54.06)較對(duì)照組(538.39±37.67)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 造模期間2、4、6、7、8周兩組大鼠體質(zhì)量的變化

3.3 大鼠宏觀證候表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)前,各組大鼠精神狀態(tài)良好、活潑好動(dòng)、皮毛光澤度好、皮膚黏膜紅潤(rùn)、球形糞便干稀適中，逃避、反抗、咬人正常。

單純性肥胖模型組大鼠造模2周后個(gè)別大鼠出現(xiàn)抹嘴，瘙癢。3周后出現(xiàn)飲水量減少，鼠尾脫皮掉毛，多數(shù)大鼠出現(xiàn)抹嘴，瘙癢。4周后個(gè)別抹嘴，坐姿有變化，挺肚子坐；個(gè)別鼠尾脫皮；逐漸出現(xiàn)糞便軟、不成形,個(gè)別大鼠糞便甚至稀溏。在造模過(guò)程中，大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡不振,扎堆,嗜睡,反應(yīng)遲鈍,行動(dòng)遲緩,毛色枯槁, 抓取時(shí)叫聲比較溫柔，情緒平穩(wěn)，尾皮鱗屑狀脫落，舌淡胖。逃避、反抗表現(xiàn)不靈敏，行動(dòng)較遲緩。

3.4 實(shí)驗(yàn)大鼠血清血脂四項(xiàng)生化分析 脾虛濕阻型單純性肥胖模型組大鼠血清血脂四項(xiàng)生化分析較對(duì)照組無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 造模期間各組大鼠血清血脂四項(xiàng)生化分析

3.5 實(shí)驗(yàn)大鼠脾組織流式細(xì)胞術(shù)分析 單純性肥胖模型組大鼠脾組織流式細(xì)胞術(shù)分析，所有淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+所占比率(20.79±1.96)較對(duì)照組(31.66±0.83)顯著降低(P<0.01)。所有淋巴細(xì)胞中CD3+、CD8+所占比率(31.27±1.65)較對(duì)照組(27.00±1.72)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表4、如圖1所示。

表4 兩組大鼠CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況

4 討論

本課題通過(guò)建立與人類高脂飲食結(jié)構(gòu)相類似、肥胖相關(guān)指標(biāo)明確的營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型，以傳統(tǒng)中醫(yī)基礎(chǔ)理論為依據(jù)，符合單純性肥胖病脾失健運(yùn)，痰濕內(nèi)停的病機(jī)。脾為后天之本，其氣主升，喜燥惡濕，脾主運(yùn)化，主肌肉四肢，為氣血生化之源，是生命的動(dòng)力源頭。當(dāng)脾臟功能正常時(shí)，可以將機(jī)體攝入的飲食水谷轉(zhuǎn)化為精微物質(zhì)，將其吸收并傳輸布散到全身，以維持人體正常的生理活動(dòng)。脂肪的攝入過(guò)量，導(dǎo)致脾失健運(yùn)，脾受濕困故出現(xiàn)大鼠進(jìn)食量減少，體重減輕，喜蜷臥扎堆。脾氣虛弱，“升清”功能減弱，不能將水谷精微物質(zhì)上輸于肺及頭目，則表現(xiàn)為精神萎靡，倦怠嗜臥。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為機(jī)體各功能的正常運(yùn)行及人體的適應(yīng)能力、防御能力和康復(fù)能力主要有賴于人體正氣的旺盛。中醫(yī)經(jīng)典著作《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)·刺法論》曰：“正氣存內(nèi)，邪不可干?！奔凑龤獬涫?，機(jī)體足以抵抗邪氣，不易發(fā)生疾??；反之“邪之所湊，其氣必虛”，當(dāng)正氣不足，邪氣趁虛而入，往往會(huì)引起機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)，從而產(chǎn)生疾病。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)，會(huì)出現(xiàn)亞健康狀態(tài)，如濕邪停滯體內(nèi)導(dǎo)致單純性肥胖的發(fā)病。濕邪阻滯氣機(jī)，會(huì)出現(xiàn)倦怠乏力，機(jī)體的活動(dòng)度、靈活度下降。正氣存內(nèi)可預(yù)防濕、痰等有形實(shí)邪的產(chǎn)生,上述正氣之效力與人體免疫系統(tǒng)有異曲同工之處。任何疾病的發(fā)生，都必然是臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血功能的失調(diào)，病程久延，還會(huì)導(dǎo)致臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血的損傷，即正氣虧虛；免疫功能是正氣的重要方面，即抗病能力，當(dāng)人體免疫功能受損時(shí),容易受到邪氣的侵襲而致病。

細(xì)胞免疫是機(jī)體抗外界免疫的主要手段，細(xì)胞免疫中T淋巴細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤免疫中起調(diào)控及免疫監(jiān)視作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最近幾年來(lái)研究比較多，在機(jī)體內(nèi)起到免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，對(duì)人體機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)的維持起了重要作用,其數(shù)量或功能的異常往往與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。目前認(rèn)為T(mén)regs主要有CD4+Treg和CD8+Treg等亞群，CD4+Treg細(xì)胞,在維持機(jī)體自身耐受和調(diào)控免疫應(yīng)答水平中起重要作用[4-6]。CD4+Th1細(xì)胞也可分泌白細(xì)胞介素2 (Interleukin 2, IL-2)和γ干擾素 (Interferon γ, IFN-γ)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫,輔助細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分化,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[7]。CD8+T淋巴細(xì)胞又稱為細(xì)胞毒細(xì)胞，起免疫抑制作用，可以殺傷受感染的細(xì)胞，包括被HIV等病毒感染的CD4+T淋巴細(xì)胞[8-9]。正常狀態(tài)下，人體中 CD4+/CD8+的比值保持平衡，免疫功能相對(duì)比較穩(wěn)定[10]。對(duì)照組的脾細(xì)胞的免疫功能：在整個(gè)淋巴細(xì)胞中，CD3+與CD4+所占的比率為(31.66±0.83)%，CD3+與CD8+所占的比率為(20.79±1.96)%，單純性肥胖模型組脾細(xì)胞的免疫功能：CD3+與CD4+所占的比率為(27.00±1.72)%，CD3+與CD8+所占的比率為31.35%。單純性肥胖模型組脾細(xì)胞的免疫功能： CD3+與CD4+所占的比率為27.27%，CD3+與CD8+所占的比率為(31.27±1.65)%。單純性肥胖模型組CD3+與CD4+在整個(gè)淋巴細(xì)胞中所占的比率降低，CD3+與CD8+在整個(gè)淋巴細(xì)胞中所占的比率增高，由此提示單純性肥胖模型的大鼠的免疫功能受到很大影響。

研究結(jié)果顯示,造模前各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單純性肥胖模型組造模后,大鼠體質(zhì)量明顯增加20%以上,與對(duì)照組比較有顯著差異。脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠的一般情況包括體質(zhì)量、精神狀態(tài)、飲水量、活動(dòng)狀態(tài)、排泄物性狀等都較對(duì)照組有明顯改變。說(shuō)明飲食自倍，腸胃乃傷。尤其是脾主運(yùn)化水谷功能的失常。然而與對(duì)照組相比，單純性肥胖模型組血清血脂四項(xiàng)生化分析(包括總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。說(shuō)明在體重增加后，短時(shí)間內(nèi)血清血脂不會(huì)發(fā)生顯著變化。這也是臨床單純性肥胖病人血清生化指標(biāo)檢測(cè)正常的原因，此時(shí)已是亞健康狀態(tài)，但血清生化指標(biāo)尚未有大的變化的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但造模成功后，免疫指標(biāo)發(fā)生了顯著變化，單純性肥胖機(jī)體抵抗力明顯下降，說(shuō)明免疫指標(biāo)較血清生化指標(biāo)更早提示機(jī)體病理狀態(tài)。