尹翼 歐朝陽(yáng) 何愛(ài)琴

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增加[1-2]。由于疾病早期缺乏特異性癥狀，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。臨床上卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的化療，盡管治療后可達(dá)到完全緩解，但仍有約60%的卵巢癌患者會(huì)在5年內(nèi)復(fù)發(fā)[4]，而且大多數(shù)患者最終會(huì)發(fā)展為鉑類耐藥[5]。目前為止，卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不清楚。因此，研究與卵巢癌惡性行為相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

GABs蛋白家族是一種高度保守的支架蛋白[6]。該家族結(jié)構(gòu)具有同源性，包括N端PH結(jié)構(gòu)域(N-terminal pleckstrin homology domain)、中央富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域和多重酪氨酸殘基[7]。目前，許多證據(jù)表明GABs蛋白在多種癌癥中異常表達(dá)，并參與多種細(xì)胞進(jìn)程，如增殖、遷移和侵襲[8-9]。據(jù)報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞中GAB2的高表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲能力[10]，卵巢癌細(xì)胞SKOV3和HO-8910中GAB2敲低后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力顯著下降，說(shuō)明GAB2在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用[11]。但是GAB2在卵巢癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究旨在評(píng)估卵巢癌組織中GAB2的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月—2016年1月在南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的119例卵巢癌患者的癌組織及其癌旁組織(經(jīng)病理證實(shí)未被癌累及的卵巢組織或輸卵管組織)制成組織微陣列。收集這些患者的臨床資料、血清腫瘤指標(biāo)、影像結(jié)果和病理結(jié)果。119例標(biāo)本包括101例漿液性癌、10例粘液性癌、2例子宮內(nèi)膜樣癌、3例透明細(xì)胞癌和3例其他類型卵巢癌。所有標(biāo)本都由2位高年資的病理科醫(yī)師重新閱片。本研究已獲得南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法

采用免疫組化(SP)法對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行染色，切片厚度約4 μm，85℃烘箱烤片30 min，二甲苯脫蠟，乙醇脫水。堿性修復(fù)液高壓加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫，過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫封閉20 min，一抗4℃過(guò)夜[GAB2(ab235932)，稀釋濃度為1∶50]。次日，復(fù)溫至室溫，DaKo免疫組化二抗室溫孵育20 min，每個(gè)步驟之間用PBS緩沖液清洗 3次，每次5 min。DAB顯色2 min，蘇木素染色30 s，乙醇脫水，二甲苯脫蠟，中性樹(shù)膠封片。

1.3 結(jié)果判定

GAB2染色陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為胞漿著色，陰性標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)胞漿著色，不論胞膜和胞核是否著色。按胞漿著色程度分為未著色、淡黃色、黃色、棕色或深棕色，所對(duì)應(yīng)染色強(qiáng)度分別為-、+、++、+++，評(píng)分分別為0、1、2、3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比<20%、21%～50%、51%～75%、>75%，評(píng)分分別為1、2、3、4分。綜合評(píng)分為兩項(xiàng)指標(biāo)乘積?；诰C合評(píng)分，根據(jù)受試者工作特征曲線(ROC)及約登指數(shù)計(jì)算最佳截?cái)嘀?，分為GAB2低表達(dá)組(<4)和高表達(dá)組(≥4)。

1.4 隨訪

所有患者在初始治療結(jié)束后1年內(nèi)每月隨訪1次，2年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次，3～5年每4～6個(gè)月隨訪1次，5年以上者每年隨訪1次。根據(jù)病人對(duì)鉑類化療藥物的敏感性，以初次治療(達(dá)到臨床緩解)停藥后6個(gè)月為界，將復(fù)發(fā)性卵巢癌分為鉑耐藥性復(fù)發(fā)和鉑敏感性復(fù)發(fā)，鉑敏感性復(fù)發(fā)定義為發(fā)生在停藥后6個(gè)月以上的復(fù)發(fā)，鉑耐藥性復(fù)發(fā)定義為發(fā)生在停藥后6個(gè)月以內(nèi)的復(fù)發(fā)?？偵嫫?Overall survival，OS)定義為從治療開(kāi)始至死亡或隨訪截止日期的時(shí)間。隨訪截止時(shí)間為2020年12月。中位隨訪時(shí)間74個(gè)月(60個(gè)月～81.24個(gè)月)，隨訪結(jié)束后存活57人，死亡62人。

1.5 Nomogram預(yù)后預(yù)測(cè)模型

運(yùn)用R 4.1.1中的survival和rms兩個(gè)程序包構(gòu)建Nomogram預(yù)后預(yù)測(cè)模型。使用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析卵巢癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素并繪制列線圖(Nomogram)；根據(jù)不同危險(xiǎn)因素對(duì)卵巢癌患者3年和5年生存率的影響程度，計(jì)算相應(yīng)得分，根據(jù)總得分評(píng)估每個(gè)患者的生存率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。使用配對(duì)卡方檢驗(yàn)分析癌與癌旁組織中GAB2的表達(dá)差異。使用卡方檢驗(yàn)和連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)分析GAB2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，采用Kaplan-Meier生存曲線和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析GAB2表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織和癌旁組織中GAB2的表達(dá)情況

利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)組織芯片中119例癌組織及其癌旁組織中GAB2的表達(dá)情況。免疫組化染色結(jié)果顯示，73例癌組織中GAB2高表達(dá)，43例癌旁組織中GAB2高表達(dá)，結(jié)果提示，GAB2在卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)(圖1，表1)。

表1 GAB2在癌組織和癌旁組織中的染色情況

2.2 GAB2表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系

基于GAB2在癌組織中的染色評(píng)分，利用ROC曲線及約登指數(shù)計(jì)算出最佳截?cái)嘀禐?，分為GAB2高表達(dá)組(≥4)和GAB2低表達(dá)組(<4)。GAB2表達(dá)量與FIGO分期、初診時(shí)CA125水平和鉑耐藥性復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P<0.05)(表2)。

圖1 GAB2在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異Figure 1 The expression of GAB2 in ovarian tumor tissues and adjacent tissuesNote：A.The high expression of GAB2 in ovarian cancer tissues.B.The low expression of GAB2 in adjacent tissues.C.The statistical analysis of GAB2 expression in ovarian tumor tissues and adjacent tissues.***P<0.001.

表2 GAB2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 GAB2表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

GAB2高表達(dá)卵巢癌患者的中位OS為20個(gè)月(95%CI：16.28～24.15)，GAB2低表達(dá)卵巢癌患者的中位OS為49.5個(gè)月(95%CI：43.75～52.25)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，與GAB2低表達(dá)組比較，GAB2高表達(dá)的卵巢癌患者的OS較差(χ2=69.692，P<0.001)。然后，根據(jù)分期情況將119例患者分為FIGO Ⅰ～Ⅱ期亞組和FIGO Ⅲ～Ⅳ期亞組，分層分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO Ⅰ～Ⅱ期亞組中，GAB2表達(dá)量與OS無(wú)相關(guān)性(χ2=1.315，P=0.252)。而FIGO Ⅲ～Ⅳ期亞組中，GAB2高表達(dá)與卵巢癌患者不良預(yù)后相關(guān)(χ2=53.991，P<0.001)(圖2)。

2.4 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

單因素Cox分析結(jié)果顯示，GAB2表達(dá)量、分期、初診時(shí)CA125水平、鉑耐藥性復(fù)發(fā)可能與卵巢癌患者OS相關(guān)(P<0.05)(表3)。多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，GAB2表達(dá)量、鉑耐藥性復(fù)發(fā)是影響卵巢癌患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表3)。

2.5 Nomogram預(yù)后模型預(yù)測(cè)卵巢癌患者5年生存率

為了更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)卵巢癌患者的生存率，本研究在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的基礎(chǔ)上構(gòu)建了Nomogram預(yù)后模型來(lái)預(yù)測(cè)患者的3年和5年生存率(圖3)。結(jié)果顯示，Nomogram預(yù)后模型能較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)卵巢癌患者3年和5年生存率(C指數(shù)為0.801，95%CI：0.781～0.822)，并且該預(yù)后模型的預(yù)測(cè)能力較好(3年AUC=0.927，5年AUC=0.809)。

表3 單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)影響卵巢癌患者OS的危險(xiǎn)因素

圖2 Kaplan-Meier曲線分析GAB2表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系Figure 2 Kaplan-Meier curves were used to analyze the relationship between GAB2 expression and prognosis of ovarian cancer patientsNote：A.Overall survival curves of GAB2 in the high expression group and low expression group；B.Survival curves of GAB2 in the high expression group and low expression group as well as FIGO I-II and FIGO III-IV subgroups.

圖3 Nomogram預(yù)后預(yù)測(cè)模型Figure 3 The Nomogram prognostic modelNote：A.Nomogram prognostic model；B.Calibration curve；C.ROC curve.

3 討論

在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中，卵巢癌發(fā)病率次于宮頸癌和子宮體癌，但是死亡率卻居首位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球卵巢癌新增病例313 959例，死亡207 252例[12]。由于卵巢癌的發(fā)病隱匿、高轉(zhuǎn)移性和治療后易發(fā)生化療耐藥[13]，使卵巢癌的治療成為一個(gè)難點(diǎn)。因此，監(jiān)測(cè)卵巢癌預(yù)后和尋找新的治療靶點(diǎn)就顯得尤為重要。

GAB2位于人染色體11q13.4-q13.5，分子量97～100 kD[14]。GAB2作為一種支架蛋白，不僅參與信號(hào)傳遞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。GAB2主要通過(guò)兩種信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。在GAB2-SHP2介導(dǎo)的RAS/ERK途徑中，酪氨酸磷酸酶(SHP2)是GAB2下游的重要效應(yīng)蛋白。GAB2與SHP2相互作用后激活下游RAS，繼而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[15-16]。據(jù)報(bào)道，GAB2過(guò)表達(dá)激活了SHP2-RAS-ERK途徑，增強(qiáng)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的誘導(dǎo)，并增加了腫瘤的滲透性[17]。GAB2參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一條通路是PI3K/AKT信號(hào)通路。GAB2在細(xì)胞因子作用下發(fā)生磷酸化，磷酸化后的GAB2作用于PI3K的p85亞基，誘導(dǎo)PI3K的激活，繼而發(fā)揮促癌的作用[18]。Tian等[19]報(bào)道GAB2通過(guò)PI3K/AKT途徑促進(jìn)前列腺癌的增殖、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。也有研究證實(shí)，大腸癌組織中GAB2表達(dá)上調(diào)與VEGF水平呈正相關(guān)。GAB2高表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和克隆形成，而沉默GAB2則抑制其增殖和克隆形成[20]。Duckworth等[21]研究證明，在GAB2缺陷的裸鼠模型中，GAB2的缺失能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和腹膜腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)，也有研究報(bào)道，GAB2表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，GAB2的高表達(dá)與卵巢癌中較短的無(wú)進(jìn)展生存率有關(guān)[22]。為了進(jìn)一步探索GAB2與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，本研究在組織芯片中比較了119例卵巢癌組織和癌旁組織中GAB2的表達(dá)差異，并分析了其表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，GAB2在卵巢癌組織中表達(dá)水平顯著升高，并且，GAB2的表達(dá)水平與FIGO分期、初診時(shí)CA125水平和鉑耐藥性復(fù)發(fā)均有顯著相關(guān)性。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果也表明，與GAB2高表達(dá)組的患者相比，GAB2低表達(dá)組的患者生存明顯較長(zhǎng)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果表明，GAB2表達(dá)水平是卵巢癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

本研究首次在組織芯片中分析GAB2在卵巢癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系。但是，在Cox回歸模型分析過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)分級(jí)與患者預(yù)后之間無(wú)明顯相關(guān)性，這似乎與臨床不符。我們分析這可能是由于制作組織芯片前我們篩選的病人存在偏倚所造成，所納入的病人中低級(jí)別8例，高級(jí)別111例。因此，GAB2與卵巢癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系仍需要更大樣本量的研究。

綜上所述，GAB2在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能起到促癌作用，并且GAB2表達(dá)與卵巢癌患者的預(yù)后相關(guān)，可作為影響卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些都提示GAB2有望成為臨床上監(jiān)測(cè)卵巢癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)，為卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)。