王雪 高雨蔚 宋紅權(quán) 張興偉 楊帆 焦曉輝

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌是全球第六大常見癌癥，而口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是其中的主要類型[1]。根據(jù)GLOBOCAN最新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，2020年OSCC新發(fā)病例高達(dá)377 713例，死亡病例達(dá)到177 757例[2]。盡管OSCC的治療手段不斷改進(jìn)，但仍然以手術(shù)治療為主，放化療為輔，患者5年生存率未見明顯改善[3]。因此，積極尋找OSCC新的診斷標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)以及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)至關(guān)重要。

白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子2(Interleukin enhancer-binding factor 2，ILF2)位于人類1號(hào)染色體1q21.3區(qū)，由ILF2基因編碼[4]；核因子90(Nuclear factor 90，NF90)，位于人類19號(hào)染色體，由ILF3基因編碼[5]。二者最早在Jurkat T細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，普遍表達(dá)于人體組織細(xì)胞核中[4-5]。ILF2與NF90可以結(jié)合，形成異二聚體復(fù)合物，共同參與DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和翻譯、調(diào)控miRNA等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，ILF2和NF90與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但與OSCC的相關(guān)研究卻未見報(bào)道。本研究通過免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)及實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)方法探究了ILF2和NF90在OSCC組織中的表達(dá)及臨床意義，以期為OSCC的早期診斷、治療方法選擇以及預(yù)后評(píng)估提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2014年1月—2019年12月就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的初發(fā)OSCC患者石蠟標(biāo)本66例，男性患者40例，女性患者26例，年齡36～88歲；組織病理分級(jí)(參考WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn))：高分化36例，中低分化30例；TNM分期(參考國(guó)際抗癌聯(lián)盟第六版)：T1～T2期27例，T3～T4期39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。選取30例非腫瘤患者正常口腔黏膜組織石蠟標(biāo)本作為對(duì)照組，男15例，女15例；年齡25～87歲，平均(54.16±17.23)歲，兩組間性別和年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。以上標(biāo)本用于IHC實(shí)驗(yàn)。選取2019年9月—2020年12月就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院確診為OSCC患者的新鮮組織標(biāo)本20例，同一患者的正常口腔黏膜(Normal oral mocusa，NOM)組織作為對(duì)照組，男11例，女9例；年齡45～82歲，平均(58.75±8.15)歲，置于-80℃冰箱凍存，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所有患者均行手術(shù)治療，術(shù)前均未經(jīng)其他治療，標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)，獲得患者知情同意和本院倫理委員會(huì)同意，所有病例臨床資料完整。

1.2 IHC

將蠟塊切成厚度為4 μm的切片，常規(guī)HE染色，鏡下確認(rèn)病理分型。將切片經(jīng)過復(fù)水及抗原修復(fù)后，滴加兔抗人ILF2抗體一抗(1∶100)，兔抗人NF90抗體一抗(1∶100)，靜置沖洗后滴加廣譜二抗，DAB顯色后復(fù)染后沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀由兩位專職病理醫(yī)生各自獨(dú)立操作，評(píng)估采用雙盲法，以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號(hào)。(1)以半定量積分法進(jìn)行陽性結(jié)果判斷，目標(biāo)蛋白染色為無著色計(jì)0分、淺黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分；(2)陽性比例按視野內(nèi)陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的比例記分，無計(jì)為0分、≤25%計(jì)1分、26%～50%計(jì)2分、51%～75%計(jì)3分、>75%計(jì)4分；(3)將每張切片于400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)組織視野，對(duì)所有視野分別計(jì)分，并將以上兩種計(jì)分結(jié)果相乘，低表達(dá)組≤4分，計(jì)為陰性(-)；高表達(dá)組>4分，計(jì)為陽性(+)[7]。

1.3 qRT-PCR

利用TRIpure裂解液提取組織中的總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣本中RNA的濃度，使用PCR儀將上述得到的RNA，以β-actin為內(nèi)參逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列見表1，最后使用熒光定量?jī)x進(jìn)行定量分析。采用2-△△Ct法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算。

表1 PCR引物序列

1.4 隨訪

采用電話隨訪的方式記錄總生存期(Overall survival，OS)。OS為自手術(shù)開始至患者死亡或隨訪截止的時(shí)間。隨訪時(shí)間范圍為11～81個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為28個(gè)月，隨訪截止時(shí)間為2020年12月31日。

1.5 ILF2和NF90的生物信息學(xué)分析

基于Oncomine數(shù)據(jù)庫(https：//www.oncomine.org/resource/login.html)對(duì)ILF2和NF90進(jìn)行分析，分析兩者在OSCC組織和NOM組織中的表達(dá)差異?；贕EPIA數(shù)據(jù)庫(http：//gepia.cancer-pku.cn/)對(duì)ILF2和NF90在OSCC中的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ILF2及NF90的表達(dá)情況

IHC結(jié)果顯示，在OSCC和NOM組織中，ILF2主要定位于細(xì)胞質(zhì)，NF90主要定位于細(xì)胞核(圖1)。其中，在OSCC組織切片中，ILF2和NF90的陽性表達(dá)率分別為68.2%和62.1%；在NOM組織切片中，ILF2和NF90的陽性表達(dá)率分別為36.7%和30.0%，ILF2和NF90在OSCC組織中的陽性表達(dá)率高于NOM組織(P=0.004)(表2)。

qRT-PCR結(jié)果顯示，與NOM組對(duì)比，ILF2和NF90在OSCC組織中均高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 ILF2 mRMA和NF90 mRNA在OSCC與NOM 組織中的表達(dá)Figure 2 The mRMA expression of ILF2 and NF90 in OSCC and NOM tissuesNote：***P<0.001，when compared with the NOM group.

圖3 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析ILF2和NF90在OSCC和NOM組織中的表達(dá)情況Figure 3 The expression of ILF2 and NF90 in OSCC and NOM groups by the Oncomine biological information databaseNote：***P<0.001，when compared with the NOM group.

Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，與NOM組織比較，ILF2和NF90在OSCC中同樣高表達(dá)(P<0.001)(圖3)。

2.2 ILF2和NF90的表達(dá)與OSCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系

ILF2及NF90與TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與OSCC患者的年齡、性別及是否吸煙無關(guān)(P>0.05)(表3)。

表3 66例OSCC患者ILF2、NF90的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ILF2與NF90在OSCC中的共表達(dá)分析

ILF2與NF90共陽性表達(dá)36例，共陰性表達(dá)16例，ILF2與NF90在OSCC中的表達(dá)存在相關(guān)性(φ=0.540，P<0.001)(表4)。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，ILF2與NF90在OSCC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.600，P<0.001)(圖4)。

表4 OSCC組織中ILF2、NF90表達(dá)的相關(guān)性

圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示ILF2和NF90(ILF3)在OSCC組織中的表達(dá)成正相關(guān)Figure 4 A positive correlation between the expression of ILF2 and NF90(ILF3)in OSCC tissues by the GEPIA database

2.4 ILF2和NF90表達(dá)與OSCC預(yù)后的關(guān)系

單因素Cox回歸分析顯示，ILF2高表達(dá)(HR=3.184，P=0.006)、NF90高表達(dá)(HR=4.425，P<0.001)、腫瘤分化程度(HR=5.025，P<0.001)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移(HR=1.385，P=0.046)可能是患者OS影響因素。多因素Cox回歸分析表明，ILF2高表達(dá)(HR=2.786，P=0.041)、NF90高表達(dá)(HR=2.392，P=0.042)、腫瘤分化程度(HR=5.618，P<0.001)是影響患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表5)。

Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，ILF2高表達(dá)患者較低表達(dá)患者的預(yù)后差(P=0.007)；同樣，NF90高表達(dá)患者的預(yù)后較低表達(dá)患者的預(yù)后差(P=0.001)(圖5)。

表5 OSCC患者OS影響因素的Cox單因素及多因素分析

圖5 ILF2和NF90高表達(dá)及低表達(dá)患者的生存曲線Figure 5 Survival curves for patients with high and low expression of ILF2 and NF90

3 討論

OSCC是口腔癌最常見的類型，5年生存率約50%，但早期發(fā)現(xiàn)和適當(dāng)治療可使治愈率提高到80%左右[8]。因此，專家學(xué)者致力于尋找OSCC的早期診斷和治療方法。本研究通過探究ILF2及NF90在OSCC中的表達(dá)及其臨床意義，為OSCC的早期診斷和治療提供新的依據(jù)。

ILF2和NF90在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，如肺非小細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、宮頸癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌及鼻咽癌等[9-17]。ILF2通過促進(jìn)14-3-3ε蛋白的表達(dá)，激活其下游的Tiam1/Rac1通路，進(jìn)而促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲與增殖[10]，而Tiam1/Rac1能重組腫瘤細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞形體極化過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移，并參與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖與凋亡[18]。早期轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞必須對(duì)抗失巢凋亡，才可能脫離原發(fā)灶獨(dú)立生存，具有錨定獨(dú)立性。ILF2通過抑制磷酸酶和緊張素同源物增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的錨定獨(dú)立性，抵抗腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡[19]，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。NF90通過PI3/AKT通路調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的表達(dá)，從而調(diào)控宮頸癌腫瘤血管的生成，沉默NF90后，宮頸癌腫瘤生長(zhǎng)被明顯抑制[13]。本研究表明ILF2、NF90在OSCC中的表達(dá)與TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)，我們合理推測(cè)ILF2及NF90在OSCC中也可能通過上述機(jī)制來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移。

ILF2和NF90復(fù)合物也與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，ILF2及NF90在OSCC組織中高表達(dá)且兩者呈正相關(guān)，我們合理推測(cè)兩者可能是以復(fù)合物的形式參與OSCC的發(fā)生發(fā)展。MicroRNA-7(miR-7)在多種腫瘤中被證實(shí)起到抑癌作用，在胰腺癌中，miR-7通過調(diào)節(jié)ILF2發(fā)揮其抑癌基因的作用[16]。在肝細(xì)胞癌中也存在相似的機(jī)制，ILF2和NF90復(fù)合物，通過抑制miR-7促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖[15]，因此在OSCC中，是否也存在類似的機(jī)制值得我們進(jìn)一步探究。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是一組長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸且缺乏蛋白質(zhì)編碼能力的RNA分子，其與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。lncRNA中有一種分化對(duì)抗非蛋白編碼RNA(Differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)，具有抑制表皮細(xì)胞分化功能，促進(jìn)多種癌癥的進(jìn)展和惡化過程。DACNR通過與ILF2和NF90復(fù)合物相結(jié)合，使缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的穩(wěn)定性增加，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲[20]。而且已有報(bào)道表明HIF-1α在OSCC中高表達(dá)[21]，所以在OSCC中，ILF2和NF90復(fù)合物、DANCR及HIF-1α的關(guān)系也值得進(jìn)一步研究。

有研究表明ILF2和NF90復(fù)合物與p53基因相關(guān)。二者的復(fù)合物在來自HPV感染的腫瘤細(xì)胞系中有抑制p53表達(dá)的作用。通過敲低ILF2和NF90復(fù)合物可以抑制病毒E6的表達(dá)，從而抑制p53的降解，恢復(fù)p21等因子的功能。這些因子依賴p53的調(diào)控，能夠在照射和化療藥物治療后的腫瘤中，有效激活腫瘤細(xì)胞的凋亡[22]，這為OSCC患者的非手術(shù)治療提供了新靶點(diǎn)。

ILF2的低表達(dá)能夠下調(diào)著絲粒相關(guān)蛋白E對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制[23]。ILF2也可作為一種乳腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物，也可以預(yù)測(cè)新輔助化療反應(yīng)[11]。NF90作為泛素特異性蛋白酶11(Ubiquitin-specific protease 11，USP11)的下游基因，與USP11結(jié)合并去泛素化，從而穩(wěn)定蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[14]，NF90被敲除后，肝癌細(xì)胞的增殖顯著降低。NF90與LincIN結(jié)合，與晚期的乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)[24]。本研究中ILF2及NF90高表達(dá)的OSCC患者OS較短，并且是影響OSCC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此ILF2及NF90也可能作為OSCC預(yù)后評(píng)估的新指標(biāo)。

綜上所述，ILF2及NF90可為OSCC的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供新的思路，但是二者在OSCC中的具體作用還需要進(jìn)一步的研究。