竇媛媛 侯靜雯 王枚

肌少癥是衰老的常見特征，表現(xiàn)為增齡相關(guān)的進行性肌肉強度和質(zhì)量的逐漸減弱。肌肉強度下降或肌肉生理功能減退伴隨著老年人體育活動和能量消耗的減少[1]。近10年來肌少癥的研究逐漸引起重視，并在基礎(chǔ)和臨床方面取得一些進展。盡管使用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)方法表征了導(dǎo)致肌減少癥的多種因素[2]，但對骨骼肌衰老相關(guān)變化的分子機制了解甚少。微小RNA(miRNA)是長度為20～22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼的RNA，參與代謝、發(fā)育、癌癥和衰老等生物過程[3]。最近，有研究證明了一些miRNA在衰老過程中差異表達，并以組織和細胞類型的特定方式參與衰老過程[4-7]。這些研究都證明了miRNA在肌肉衰老過程中的重要作用[8]。本研究對年輕和老年小鼠腓腸肌miRNA和mRNA數(shù)據(jù)庫進行聯(lián)合分析，通過下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)研究miRNA在骨骼肌衰老中的潛在作用，以精確鑒定成熟和新穎的miRNA，以期為解析肌少癥的發(fā)生和尋找肌少癥新的分子標記物及靶點提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 基因表達譜數(shù)據(jù)下載 數(shù)據(jù)來源于美國國立生物技術(shù)信息中心 (national center for biotechnology information，NCBI)的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus, GEO)，包含5只青年小鼠和5只老年小鼠骨骼肌樣本的RNAseq數(shù)據(jù)(GSE55163)及6只青年小鼠和6只老年小鼠骨骼肌樣本的miRNAseq數(shù)據(jù)(GSE55164)。所有樣本采用NextSeq 500 芯片進行表達基因的測序用于后續(xù)分析。

1.2 樣本的聚類和差異基因分析 采用基于陣列間歸一化功能對數(shù)據(jù)進行背景校正和標準化，篩選出對照探針和低表達探針，獲得高質(zhì)量的標準化數(shù)據(jù)。采用R語言中的limma 軟件包的lmFit和eBayes函數(shù)分析差異表達基因。差異表達基因的篩選條件為P<0.05且log2 FC>1.5。

1.3 功能和途徑富集分析 使用R語言Clusterprofiler包對差異表達基因進行基因本體(gene ontology，GO)和功能富集分析。利用Cytoscape的CluGO應(yīng)用對差異表達基因進行京東基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。此外，通過表達分析系統(tǒng)(GSEA)軟件分析差異表達基因參與的GO功能和KEGG信號通路。P<0.05被定義為重要功能和通路分析的臨界值。

1.4 miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用mirTarbase和TargetScan(6.2版，http：//www.targetscan.org)數(shù)據(jù)庫來預(yù)測每個miRNA的潛在靶標mRNA(互作關(guān)系評分>0.5)。基于預(yù)測的miRNA-mRNA關(guān)系，選擇顯示表達相反的miRNA-mRNA,采用Cytoscape(3.0版，www.cytoscape.org/)構(gòu)建miRNA和mRNA之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 樣品收集 2020年4月從新疆醫(yī)科大學(xué)實驗室動物資源中心購買12只青年(6個月大)和13只老年(24個月大)雄性C57BL/6小鼠，每組小鼠體質(zhì)量接近且健康。在處死之前，記錄小鼠的體質(zhì)量，分離腓腸肌。

1.6 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR) 使用mirVanaTMmiRNA分離試劑盒試劑(Thermo，USA)分離小鼠腓腸肌總RNA，將總RNA(1μg)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后使用羅氏480II檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems, USA)進行實時定量PCR。

1.7 Western blot 檢測蛋白表達 使用總蛋白提取試劑盒(碧云天，江蘇)從腓腸肌中提取總蛋白。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠(SDS-PAGE)上分離蛋白質(zhì)(50μg)，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(Millipore，USA)上。室溫下用Tris緩沖鹽水配置的5%奶粉將膜封閉1 h。用PBS洗滌3次后，將膜與一抗(Rybp抗體, 1∶600; GAPDH抗體，1∶2000; Abcam, USA)在37 ℃孵育2 h，然后加辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液(1∶4000；sc-358914;Abcam, USA)，37 ℃搖床下孵育1 h。使用ECL檢測試劑盒(Pierce，USA)檢測信號。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。采用兩尾Student′st檢驗來分析2組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果 共鑒定到差異表達的基因877個，其中老年小鼠骨骼肌中上調(diào)基因747個，下調(diào)基因130個(圖1 A和B)。共鑒定到差異表達的miRNA 84個，其中老年小鼠骨骼肌中上調(diào)miRNA 52個，下調(diào)miRNA 32個(圖1 C和D)。

圖1 差異miRNA和mRNA篩選

2.2 差異miRNA靶基因預(yù)測及miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 共篩選到miRNA靶基因1765個，其中有112個基因與差異基因重復(fù)。構(gòu)建了這112個基因和miRNA的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果包含21個miRNA。其中靶向基因超過7個的miRNA有9個，分別為：miR-122-5p，miR-127，miR-137-3p，miR-200a-3p，miR-375-3p，miR-449a-5p，miR-5101，miR-758-3p，miR-873a-5p。

2.3 代表性差異miRNA的驗證 通過qRT-PCR分析了來自青年(6個月大)和老年(24個月大)小鼠腓腸肌的9種代表性miRNA表達變化。來自測序數(shù)據(jù)中代表性的4個下調(diào)的miRNA的qRT-PCR結(jié)果與測序結(jié)果一致(圖2A)。來自測序數(shù)據(jù)的所有5個上調(diào)的miRNA在qRT-PCR中均上調(diào)，其中miR-375-3p在qRT-PCR結(jié)果中上調(diào)倍數(shù)高于測序結(jié)果(圖2B)。

圖2 代表性差異miRNA的驗證

2.4 差異靶基因的GO分析 GO功能注釋分類統(tǒng)計分析顯示，差異靶基因顯著富集的生物過程除了基因轉(zhuǎn)錄、表達和細胞遷移調(diào)節(jié)外，還有細胞周期和骨骼肌細胞分化過程。其中骨骼肌分化過程中包含了早期生長反應(yīng)蛋白2(EGR2)、環(huán)1(Ring1)人轉(zhuǎn)錄因子 Yin-Yang1(YY1)和 Ring1 和 YY1 結(jié)合蛋白(Rybp)基因。而在細胞組成分中，差異表達基因與細胞外泌體、核及髓鞘形成中相關(guān)性較高。分子功能中，蛋白質(zhì)及其復(fù)合物結(jié)合和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄共抑制活性過程中占比較高(圖3)。

圖3 差異靶基因的GO分析

2.5 EGR2、Rybp、Ring1和YY1基因的驗證 通過qRT-PCR證實了骨骼肌分化過程中，老年組所有4個基因的mRNA水平與青年組相比均顯著升高(P<0.05, 圖4A)。其中，Rybp，Ring1和YY1結(jié)合蛋白在損傷性肌肉再生中負責(zé)調(diào)節(jié)骨骼肌的新生[9]。在老年小鼠的肌肉中，Rybp在蛋白質(zhì)水平上也有所增加(圖4B)。這些結(jié)果表明，Rybp及其推測的調(diào)控性miRNA miR-136可能促進了肌肉衰老過程。

圖4 EGR2, Rybp, Ring 1和YY基因的驗證

3 討論

本研究通過系統(tǒng)地分析青年和老年小鼠骨骼肌的miRNA和mRNA基因表達譜，總共鑒定出84種差異表達miRNA，其靶基因與mRNA聯(lián)合分析后發(fā)現(xiàn)21個miRNA與年齡相關(guān)。在下調(diào)的miRNA中，miR-127和miR-136a-5p屬于骨骼肌中最豐富的miRNA。MiR-127被鑒定為富含心臟瓣膜的miRNA[10]；但是，以前沒有關(guān)于其在骨骼肌發(fā)育中作用的報道。MiR-136a-5p是下調(diào)的miRNA之一，被鑒定為通過ROCK1基因促進成肌分化的成肌miRNA。MiR-137-3p是上調(diào)倍數(shù)最多的差異miRNA，它通過抑制MEF2A來抑制骨骼肌的分化[11]。因此，根據(jù)其表達和在肌發(fā)生中的作用，miR-127和miR-137-3p可能通過肌肉分化或再生參與了衰老過程。已有的研究報告了隨著年齡的增長，骨骼肌中miRNA表達的全基因組表達譜[12-13]。最近，報道了基于恒河猴不同年齡骨骼肌miRNA表達譜的改變[14]。但在先前的研究中，還沒有關(guān)于小鼠骨骼肌中差異表達miRNA的研究。因此，我們的數(shù)據(jù)對以前的研究進行了有效的補充。

大多數(shù)哺乳動物的miRNA基因散布在不同的基因組位置，但是一些miRNA基因聚集在相同的基因組中[15]。有些miRNA簇包含2～3個miRNA基因，而有些是包含超過50個miRNA基因的巨型簇。簇狀的miRNA通常朝向相同的方向，并以類似表達模式的多順反子方式轉(zhuǎn)錄。位于人14號染色體(小鼠12號染色體)上的印跡Dlk1-Dio3基因組區(qū)域包含父本表達的基因Dlk1、Rtl1和Dio3以及母本表達的非編碼RNA基因Meg3(Gtl2)和Meg8(Rian)以及反義Rtl1(anti-Rtl1)[16]。此外，Dlk1-Dio3區(qū)包含54個miRNA，這是人類基因組中發(fā)現(xiàn)的最大miRNA簇[17]。本研究中鑒定出的4個下調(diào)的miRNA中有3個(75%)屬于源自小鼠遠端12號染色體上Dlk1- Dio3區(qū)的miRNA簇，并且在肌肉中的方向相同。

Dlk1-Dio3區(qū)域內(nèi)的miRNA簇和基因在各種疾病(如癌癥和精神分裂癥)以及骨骼肌發(fā)育中受到差異調(diào)節(jié)[18]。綿羊Dlk1、Gtl2、Rtl1和Meg8的表達在骨骼肌中豐富，而Dlk1和Rtl1的過表達與Callipyge綿羊的肌肉肥大密切相關(guān)[19]。Gtl2-Dio3 miRNA簇介導(dǎo)的MEF2A對WNT信號的調(diào)節(jié)是骨骼肌再生所必需的[20]。通過對小RNA-Seq和mRNA-Seq數(shù)據(jù)的綜合分析，我們使用TargetScan算法鑒定了由9個年齡調(diào)控的miRNA靶向的94個mRNA(去除重復(fù))。GO分析顯示，下調(diào)miRNA靶向的基因(例如Ccna2、Egr2、Klf4、Klf6、Mafb、Nfya和Rybp基因)主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。其中，有報道指出，在成肌過程中，miR-136下調(diào)了Ring1和Rybp，并在損傷誘導(dǎo)的肌肉再生中作為骨骼肌發(fā)生的負調(diào)節(jié)劑[9]。這些結(jié)果表明，Rybp及其推測的調(diào)控性miRNA miR-136可能有助于肌肉衰老。

綜上，我們在骨骼肌中鑒定出9種與年齡相關(guān)的miRNA。通過分析miRNA與mRNA的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)miRNA主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來促進肌肉衰老。本研究為miRNA在骨骼肌衰老中的作用機制研究奠定了基礎(chǔ)。