竇媛媛 侯靜雯 王枚

肌少癥是衰老的常見(jiàn)特征，表現(xiàn)為增齡相關(guān)的進(jìn)行性肌肉強(qiáng)度和質(zhì)量的逐漸減弱。肌肉強(qiáng)度下降或肌肉生理功能減退伴隨著老年人體育活動(dòng)和能量消耗的減少[1]。近10年來(lái)肌少癥的研究逐漸引起重視，并在基礎(chǔ)和臨床方面取得一些進(jìn)展。盡管使用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)方法表征了導(dǎo)致肌減少癥的多種因素[2]，但對(duì)骨骼肌衰老相關(guān)變化的分子機(jī)制了解甚少。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼的RNA，參與代謝、發(fā)育、癌癥和衰老等生物過(guò)程[3]。最近，有研究證明了一些miRNA在衰老過(guò)程中差異表達(dá)，并以組織和細(xì)胞類(lèi)型的特定方式參與衰老過(guò)程[4-7]。這些研究都證明了miRNA在肌肉衰老過(guò)程中的重要作用[8]。本研究對(duì)年輕和老年小鼠腓腸肌miRNA和mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聯(lián)合分析，通過(guò)下一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)研究miRNA在骨骼肌衰老中的潛在作用，以精確鑒定成熟和新穎的miRNA，以期為解析肌少癥的發(fā)生和尋找肌少癥新的分子標(biāo)記物及靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)下載 數(shù)據(jù)來(lái)源于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (national center for biotechnology information，NCBI)的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus, GEO)，包含5只青年小鼠和5只老年小鼠骨骼肌樣本的RNAseq數(shù)據(jù)(GSE55163)及6只青年小鼠和6只老年小鼠骨骼肌樣本的miRNAseq數(shù)據(jù)(GSE55164)。所有樣本采用NextSeq 500 芯片進(jìn)行表達(dá)基因的測(cè)序用于后續(xù)分析。

1.2 樣本的聚類(lèi)和差異基因分析 采用基于陣列間歸一化功能對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化，篩選出對(duì)照探針和低表達(dá)探針，獲得高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。采用R語(yǔ)言中的limma 軟件包的lmFit和eBayes函數(shù)分析差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因的篩選條件為P<0.05且log2 FC>1.5。

1.3 功能和途徑富集分析 使用R語(yǔ)言Clusterprofiler包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)和功能富集分析。利用Cytoscape的CluGO應(yīng)用對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行京東基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。此外，通過(guò)表達(dá)分析系統(tǒng)(GSEA)軟件分析差異表達(dá)基因參與的GO功能和KEGG信號(hào)通路。P<0.05被定義為重要功能和通路分析的臨界值。

1.4 miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用mirTarbase和TargetScan(6.2版，http：//www.targetscan.org)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)每個(gè)miRNA的潛在靶標(biāo)mRNA(互作關(guān)系評(píng)分>0.5)?；陬A(yù)測(cè)的miRNA-mRNA關(guān)系，選擇顯示表達(dá)相反的miRNA-mRNA,采用Cytoscape(3.0版，www.cytoscape.org/)構(gòu)建miRNA和mRNA之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 樣品收集 2020年4月從新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物資源中心購(gòu)買(mǎi)12只青年(6個(gè)月大)和13只老年(24個(gè)月大)雄性C57BL/6小鼠，每組小鼠體質(zhì)量接近且健康。在處死之前，記錄小鼠的體質(zhì)量，分離腓腸肌。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR) 使用mirVanaTMmiRNA分離試劑盒試劑(Thermo，USA)分離小鼠腓腸肌總RNA，將總RNA(1μg)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后使用羅氏480II檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

1.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用總蛋白提取試劑盒(碧云天，江蘇)從腓腸肌中提取總蛋白。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠(SDS-PAGE)上分離蛋白質(zhì)(50μg)，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(Millipore，USA)上。室溫下用Tris緩沖鹽水配置的5%奶粉將膜封閉1 h。用PBS洗滌3次后，將膜與一抗(Rybp抗體, 1∶600; GAPDH抗體，1∶2000; Abcam, USA)在37 ℃孵育2 h，然后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶4000；sc-358914;Abcam, USA)，37 ℃搖床下孵育1 h。使用ECL檢測(cè)試劑盒(Pierce，USA)檢測(cè)信號(hào)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用兩尾Student′st檢驗(yàn)來(lái)分析2組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理結(jié)果 共鑒定到差異表達(dá)的基因877個(gè)，其中老年小鼠骨骼肌中上調(diào)基因747個(gè)，下調(diào)基因130個(gè)(圖1 A和B)。共鑒定到差異表達(dá)的miRNA 84個(gè)，其中老年小鼠骨骼肌中上調(diào)miRNA 52個(gè)，下調(diào)miRNA 32個(gè)(圖1 C和D)。

圖1 差異miRNA和mRNA篩選

2.2 差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)及miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 共篩選到miRNA靶基因1765個(gè)，其中有112個(gè)基因與差異基因重復(fù)。構(gòu)建了這112個(gè)基因和miRNA的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果包含21個(gè)miRNA。其中靶向基因超過(guò)7個(gè)的miRNA有9個(gè)，分別為：miR-122-5p，miR-127，miR-137-3p，miR-200a-3p，miR-375-3p，miR-449a-5p，miR-5101，miR-758-3p，miR-873a-5p。

2.3 代表性差異miRNA的驗(yàn)證 通過(guò)qRT-PCR分析了來(lái)自青年(6個(gè)月大)和老年(24個(gè)月大)小鼠腓腸肌的9種代表性miRNA表達(dá)變化。來(lái)自測(cè)序數(shù)據(jù)中代表性的4個(gè)下調(diào)的miRNA的qRT-PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致(圖2A)。來(lái)自測(cè)序數(shù)據(jù)的所有5個(gè)上調(diào)的miRNA在qRT-PCR中均上調(diào)，其中miR-375-3p在qRT-PCR結(jié)果中上調(diào)倍數(shù)高于測(cè)序結(jié)果(圖2B)。

圖2 代表性差異miRNA的驗(yàn)證

2.4 差異靶基因的GO分析 GO功能注釋分類(lèi)統(tǒng)計(jì)分析顯示，差異靶基因顯著富集的生物過(guò)程除了基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)外，還有細(xì)胞周期和骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程。其中骨骼肌分化過(guò)程中包含了早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白2(EGR2)、環(huán)1(Ring1)人轉(zhuǎn)錄因子 Yin-Yang1(YY1)和 Ring1 和 YY1 結(jié)合蛋白(Rybp)基因。而在細(xì)胞組成分中，差異表達(dá)基因與細(xì)胞外泌體、核及髓鞘形成中相關(guān)性較高。分子功能中，蛋白質(zhì)及其復(fù)合物結(jié)合和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄共抑制活性過(guò)程中占比較高(圖3)。

圖3 差異靶基因的GO分析

2.5 EGR2、Rybp、Ring1和YY1基因的驗(yàn)證 通過(guò)qRT-PCR證實(shí)了骨骼肌分化過(guò)程中，老年組所有4個(gè)基因的mRNA水平與青年組相比均顯著升高(P<0.05, 圖4A)。其中，Rybp，Ring1和YY1結(jié)合蛋白在損傷性肌肉再生中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)骨骼肌的新生[9]。在老年小鼠的肌肉中，Rybp在蛋白質(zhì)水平上也有所增加(圖4B)。這些結(jié)果表明，Rybp及其推測(cè)的調(diào)控性miRNA miR-136可能促進(jìn)了肌肉衰老過(guò)程。

圖4 EGR2, Rybp, Ring 1和YY基因的驗(yàn)證

3 討論

本研究通過(guò)系統(tǒng)地分析青年和老年小鼠骨骼肌的miRNA和mRNA基因表達(dá)譜，總共鑒定出84種差異表達(dá)miRNA，其靶基因與mRNA聯(lián)合分析后發(fā)現(xiàn)21個(gè)miRNA與年齡相關(guān)。在下調(diào)的miRNA中，miR-127和miR-136a-5p屬于骨骼肌中最豐富的miRNA。MiR-127被鑒定為富含心臟瓣膜的miRNA[10]；但是，以前沒(méi)有關(guān)于其在骨骼肌發(fā)育中作用的報(bào)道。MiR-136a-5p是下調(diào)的miRNA之一，被鑒定為通過(guò)ROCK1基因促進(jìn)成肌分化的成肌miRNA。MiR-137-3p是上調(diào)倍數(shù)最多的差異miRNA，它通過(guò)抑制MEF2A來(lái)抑制骨骼肌的分化[11]。因此，根據(jù)其表達(dá)和在肌發(fā)生中的作用，miR-127和miR-137-3p可能通過(guò)肌肉分化或再生參與了衰老過(guò)程。已有的研究報(bào)告了隨著年齡的增長(zhǎng)，骨骼肌中miRNA表達(dá)的全基因組表達(dá)譜[12-13]。最近，報(bào)道了基于恒河猴不同年齡骨骼肌miRNA表達(dá)譜的改變[14]。但在先前的研究中，還沒(méi)有關(guān)于小鼠骨骼肌中差異表達(dá)miRNA的研究。因此，我們的數(shù)據(jù)對(duì)以前的研究進(jìn)行了有效的補(bǔ)充。

大多數(shù)哺乳動(dòng)物的miRNA基因散布在不同的基因組位置，但是一些miRNA基因聚集在相同的基因組中[15]。有些miRNA簇包含2～3個(gè)miRNA基因，而有些是包含超過(guò)50個(gè)miRNA基因的巨型簇。簇狀的miRNA通常朝向相同的方向，并以類(lèi)似表達(dá)模式的多順?lè)醋臃绞睫D(zhuǎn)錄。位于人14號(hào)染色體(小鼠12號(hào)染色體)上的印跡Dlk1-Dio3基因組區(qū)域包含父本表達(dá)的基因Dlk1、Rtl1和Dio3以及母本表達(dá)的非編碼RNA基因Meg3(Gtl2)和Meg8(Rian)以及反義Rtl1(anti-Rtl1)[16]。此外，Dlk1-Dio3區(qū)包含54個(gè)miRNA，這是人類(lèi)基因組中發(fā)現(xiàn)的最大miRNA簇[17]。本研究中鑒定出的4個(gè)下調(diào)的miRNA中有3個(gè)(75%)屬于源自小鼠遠(yuǎn)端12號(hào)染色體上Dlk1- Dio3區(qū)的miRNA簇，并且在肌肉中的方向相同。

Dlk1-Dio3區(qū)域內(nèi)的miRNA簇和基因在各種疾病(如癌癥和精神分裂癥)以及骨骼肌發(fā)育中受到差異調(diào)節(jié)[18]。綿羊Dlk1、Gtl2、Rtl1和Meg8的表達(dá)在骨骼肌中豐富，而Dlk1和Rtl1的過(guò)表達(dá)與Callipyge綿羊的肌肉肥大密切相關(guān)[19]。Gtl2-Dio3 miRNA簇介導(dǎo)的MEF2A對(duì)WNT信號(hào)的調(diào)節(jié)是骨骼肌再生所必需的[20]。通過(guò)對(duì)小RNA-Seq和mRNA-Seq數(shù)據(jù)的綜合分析，我們使用TargetScan算法鑒定了由9個(gè)年齡調(diào)控的miRNA靶向的94個(gè)mRNA(去除重復(fù))。GO分析顯示，下調(diào)miRNA靶向的基因(例如Ccna2、Egr2、Klf4、Klf6、Mafb、Nfya和Rybp基因)主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。其中，有報(bào)道指出，在成肌過(guò)程中，miR-136下調(diào)了Ring1和Rybp，并在損傷誘導(dǎo)的肌肉再生中作為骨骼肌發(fā)生的負(fù)調(diào)節(jié)劑[9]。這些結(jié)果表明，Rybp及其推測(cè)的調(diào)控性miRNA miR-136可能有助于肌肉衰老。

綜上，我們?cè)诠趋兰≈需b定出9種與年齡相關(guān)的miRNA。通過(guò)分析miRNA與mRNA的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)miRNA主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)肌肉衰老。本研究為miRNA在骨骼肌衰老中的作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。