趙桐樺，徐心悅，羅麟霜，萬麗瓊，索玉凱

云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實驗室（昆明 650500）

咖啡的產(chǎn)量、消費(fèi)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量均位列世界首位，是世界三大飲料之一[1]。云南省咖啡種植面積、產(chǎn)量和產(chǎn)值均占全國98%以上，是我國咖啡的主產(chǎn)區(qū)，主要種植在普洱、保山、德宏、臨滄、西雙版納等地[2-3]。在咖啡加工生產(chǎn)中，除了能收獲咖啡豆以外，還會產(chǎn)生大量的咖啡果皮、種殼和果膠殘渣等副產(chǎn)物[4]。其中咖啡果皮可以占到咖啡鮮果的50%左右，這導(dǎo)致云南省每年將有50 t噸果皮亟待處理[5]。因此，怎樣實現(xiàn)咖啡副產(chǎn)物的綜合利用，對于貫徹云南咖啡產(chǎn)業(yè)的健康綠色發(fā)展至關(guān)重要。

乙醇由于具有環(huán)保、可再生及辛烷值高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是極具發(fā)展前景的可再生清潔能源之一[6]。以農(nóng)業(yè)廢棄物和木質(zhì)纖維素為原料的第二代乙醇工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)不僅降低了燃料乙醇的生產(chǎn)成本，還可以解決農(nóng)林廢棄物對環(huán)境的不利影響[7]?？Х裙ぷ鳛榭Х犬a(chǎn)業(yè)的廢棄物，被證實富含糖類、纖維素和半纖維素等物質(zhì)，是生物乙醇發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)原料[8]。與此同時，咖啡濕法發(fā)酵液中含有大量酵母，其不僅可以有效利用咖啡果皮中的糖類物質(zhì)，還對咖啡中的綠原酸、咖啡酸等抑菌物質(zhì)具有良好的抗性[9]。因此，試驗從云南小?？Х葷穹òl(fā)酵液中分離優(yōu)良的產(chǎn)醇酵母，并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而為以咖啡果皮為原料的乙醇發(fā)酵奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小?？Х葷穹òl(fā)酵液采自云南省保山市潞江壩，于4 ℃冷藏備用。

1.2 培養(yǎng)基

1) YPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，固體YPD培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L。

2) 發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖250 g/L，固體發(fā)酵培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L。

1.3 試劑

酵母粉、蛋白胨（中國賽默飛世爾科技有限公司）；葡萄糖（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；黃豆粉（上海源葉生物科技有限公司）；瓊脂（廣州賽國生物科技有限公司）；正丙醇（上海麥克林生化科技股份有限公司）；無水乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.4 儀器與設(shè)備

THZ-98A恒溫振蕩器（上海一恒科技有限公司）；TP600 PCR儀（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；PB-10酸度計（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DHP-9082B電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；D-37520小型臺式離心機(jī)（德國希格瑪實驗室離心機(jī)公司）；7890B氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.5 產(chǎn)醇菌株的篩選鑒定

在小粒咖啡濕法發(fā)酵后期取樣，并于4 ℃保存，備用。在超凈臺中，對咖啡發(fā)酵液樣品進(jìn)行梯度稀釋，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6和10-7梯度的稀釋液。將7個梯度稀釋液分別涂布至YPD固體培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)2~4 d，待平板上長出菌落，對其進(jìn)行劃線培養(yǎng)分離。將菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基，選取在發(fā)酵過程中能夠散發(fā)出酒香的菌株。將產(chǎn)醇菌株再次接種于發(fā)酵培養(yǎng)基并發(fā)酵，使用氣相色譜儀測定乙醇質(zhì)量濃度。對產(chǎn)醇質(zhì)量濃度最高的菌株進(jìn)行5.8S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribe spacer，ITS）測序，并采用MEGA6.0軟件以Neighbor Join方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 單因素試驗

為優(yōu)化菌株的產(chǎn)醇條件，分別對發(fā)酵時間（12，24，36，48，60，72，84，96和108 h）、發(fā)酵溫度（24，28，32和36 ℃）、氮源種類（酵母粉、蛋白胨、牛肉膏和黃豆粉）及添加量（10，20，30，40和50 g/L）、初始pH（2.0，3.0，4.0，5.0和6.0）進(jìn)行單因素試驗。

1.7 Box-Behnken試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用Box-Behnken模型設(shè)計試驗，選取發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、黃豆粉添加量（C）、初始pH（D）作為自變量，以乙醇質(zhì)量濃度（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定最佳發(fā)酵工藝條件。Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.8 統(tǒng)計分析

所有試驗做3個平行，2個重復(fù)。采用SPSS 16.0、Origin 2021和Design-Expert 12軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)醇菌株的篩選

從小?？Х劝l(fā)酵液中共分離到20余株菌，其中3株可以在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酒香。如圖1所示，3株菌在YPD固體平板上形成的菌落質(zhì)地均勻，形狀呈圓形，乳白色，菌體表面光滑濕潤，黏稠，易挑起，比細(xì)菌菌落大而厚，形態(tài)學(xué)觀察初步認(rèn)定篩選菌株為酵母菌屬。

圖1 3株酵母菌的菌落形態(tài)

如表2所示，在250 g/L糖濃度下，YMU01、YMU02和YMU03的乙醇質(zhì)量濃度分別為92.30，76.07和99.72 g/L。因此，后續(xù)試驗中將對YMU03的產(chǎn)醇條件進(jìn)行優(yōu)化。

表2 3株菌株所產(chǎn)的乙醇質(zhì)量濃度

2.2 產(chǎn)醇菌株的鑒定

對YMU03菌株的ITS部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果表明片段的有效長度為597 bp。將得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比較，選取與該序列同源性較高的菌株所對應(yīng)的ITS序列，并使用Neighbor Join法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。如圖2所示，菌株YMU03與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）的ITS序列同源性較高，且與W.anomalusF-X19-4聚于同一個分支，同源性達(dá)99%以上，可初步確定該菌株為W.anomalus。

圖2 菌株YMU03基于ITS序列進(jìn)化樹

2.3 單因素對產(chǎn)醇的影響

如圖3（A）所示，發(fā)酵時間為72 h時，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)97.54 g/L，72 h之后隨著時間的延長，乙醇質(zhì)量濃度不斷下降，這可能是培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分逐漸消耗殆盡，以及細(xì)胞代謝廢物的累積所導(dǎo)致。如圖3（B）所示，發(fā)酵溫度也會對乙醇發(fā)酵產(chǎn)生影響，發(fā)酵溫度28 ℃時，菌株的產(chǎn)醇質(zhì)量濃度達(dá)到最高值，為101.41 g/L。在以酵母粉、蛋白胨、牛肉膏為氮源時，該菌株的乙醇質(zhì)量濃度較低，而以黃豆粉為氮源時，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)113.37 g/L（圖3C）。為確定黃豆粉的添加量，考察不同添加量黃豆粉對乙醇質(zhì)量濃度的影響。結(jié)果表明，隨著黃豆粉添加量的升高，該菌乙醇質(zhì)量濃度逐漸升高，添加量為40 g/L時乙醇質(zhì)量濃度最高（圖3D）。如圖4（E）所示，初始pH也對YMU03的產(chǎn)醇有較大影響。pH 5.0時，乙醇質(zhì)量濃度最高，為91.23 g/L。pH＜5.0時，乙醇質(zhì)量濃度隨著pH的增加而增大，pH大于5.0時，乙醇質(zhì)量濃度會逐步降低。因此，優(yōu)化pH的最佳范圍是4.0~6.0。

圖3 發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、氮源種類（C）、黃豆粉添加量（D）、初始pH（E）對乙醇質(zhì)量濃度的影響

圖4 各因素交互作用的等高線圖

2.4 Box-Behnken優(yōu)化試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素發(fā)酵試驗的結(jié)果，選取發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、黃豆粉添加量（C）、初始pH（D）作為自變量，每個因素設(shè)置3個水平，以乙醇質(zhì)量濃度（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗，其因素水平和試驗結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design-Expert 12軟件對上述試驗結(jié)果進(jìn)行分析，可以得到以乙醇質(zhì)量濃度為響應(yīng)值的回歸方程：Y=127.65+1.81A+1.07B-1.72C-2.29D+1.23AB-1.78AC+0.552 5AD+2.46BC+6.39BD+0.937 5CD-19.52A2-17.64B2-15.60C2-10.42D2。

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.960 6，接近于1.0，說明試驗值與預(yù)測值接近，擬合度較好；矯正系數(shù)Radj2為0.921 1，進(jìn)一步證實這一結(jié)論。模型P＜0.000 1，表明模型差異性極其顯著，表示方程與實際情況擬合程度較好，能夠用于反映乙醇質(zhì)量濃度與各因素之間的關(guān)系。失擬項P＞0.05，說明失擬項差異不顯著，表明其他因素對試驗影響很小，可應(yīng)用于乙醇發(fā)酵條件的優(yōu)化。

2.5 響應(yīng)曲面交互作用分析

如圖4所示，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、黃豆粉添加量和發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH的變化對乙醇質(zhì)量濃度的影響可以通過兩兩之間的等高線圖表示。等高線呈橢圓形說明所選研究因素之間的交互作用顯著，呈圓形則說明所選研究因素之間的交互作用不顯著[10-12]。發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度、黃豆粉添加量與pH的等高線呈現(xiàn)近似圓形，說明交互作用不顯著。發(fā)酵溫度與pH、發(fā)酵溫度與黃豆粉添加量的等高線呈橢圓形，說明交互作用顯著。

對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，YMU03菌株產(chǎn)醇的最適條件為發(fā)酵時間72.6 h、發(fā)酵溫度28.0 ℃、黃豆粉添加量39.4 g/L、初始pH 4.9。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，YMU03菌株的產(chǎn)醇濃度達(dá)127.9 g/L?？紤]到實際情況，進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)3次，發(fā)酵產(chǎn)乙醇的結(jié)果值為127.5±0.87 g/L，與預(yù)測值相接近。

3 結(jié)論

為篩選云南小?？Х劝l(fā)酵液中的產(chǎn)醇酵母，試驗對發(fā)酵后期脫膠液中的菌種進(jìn)行篩選及產(chǎn)醇條件優(yōu)化，發(fā)酵試驗表明菌株YMU03具有優(yōu)良的產(chǎn)醇能力。在單因素試驗基礎(chǔ)上，分析發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、黃豆粉添加量和初始pH這4個因素對發(fā)酵產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度的影響，依據(jù)試驗結(jié)果設(shè)計四因素三水平29個試驗。經(jīng)過Design-Expert 12軟件的響應(yīng)面優(yōu)化分析，結(jié)果表明，在發(fā)酵時間72.6 h、發(fā)酵溫度28.0 ℃、黃豆粉添加量39.4 g/L、初始pH 4.9的條件下進(jìn)行發(fā)酵，YMU03的產(chǎn)醇濃度可達(dá)127.9 g/L。考慮到實際情況，進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)3次，發(fā)酵產(chǎn)乙醇的結(jié)果值為127.5±0.87 g/L，與預(yù)測值127.9 g/L相接近。實測值與模型預(yù)測值相接近，說明所建模型、采用的優(yōu)化方法與實際情況擬合程度較高，結(jié)果可靠，適用于菌株YMU03進(jìn)行乙醇發(fā)酵的條件優(yōu)化和分析。優(yōu)化后菌株YMU03的產(chǎn)醇濃度比未優(yōu)化前提高27.8 g/L，能大幅增加原材料的利用率，節(jié)省生產(chǎn)成本。后續(xù)可將菌株YMU03用于咖啡果酒及以咖啡廢棄物為底物的乙醇發(fā)酵，促進(jìn)咖啡產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。