張肖靜 位登輝 張紅麗 馬冰冰 張 涵

(鄭州輕工業(yè)大學材料與化學工程學院，河南 鄭州 450002)

城市河道是城市生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，承擔著提供水源、防洪排澇、調(diào)節(jié)氣候、降低環(huán)境污染的重要任務(wù)[1-2]。然而，近年來隨著城市及工業(yè)的快速發(fā)展，大量污染物進入城市河道引起水體黑臭現(xiàn)象，嚴重影響了城市發(fā)展和人居生活[3]，[4]1331。國內(nèi)外學者對河道黑臭問題進行了大量研究。結(jié)果表明，氮、硫是進入城市河道的主要污染物，也是導(dǎo)致水體黑臭、破壞河道生態(tài)環(huán)境的首要原因[4]1331，[5]。

自國務(wù)院公布《水污染防治行動計劃》要求2030年徹底消除黑臭水體以來，全國各地廣泛開展的整治工作取得了顯著成效，河道污染負荷大幅度削減，黑臭現(xiàn)象逐步改善。然而，目前雖然大部分外源污染輸入得到了有效控制，河道中累積的內(nèi)源污染物依然沒有得到徹底消除，并不斷向水體釋放，底泥由污染物的“匯”轉(zhuǎn)變?yōu)椤霸础盵6-8]，底泥內(nèi)源氮和硫成為水體氮、硫污染的主要來源，并影響到河道中的氮、硫轉(zhuǎn)化過程[9-11]。底泥中含有大量微生物，積極參與著河道系統(tǒng)的氮、硫循環(huán)。因此，明晰城市河道底泥的微生物組成特征，以及各種氮、硫轉(zhuǎn)化過程的潛力，有助于明確污染物削減方法及底泥修復(fù)強化手段，對于徹底解決城市河道黑臭問題至關(guān)重要。

本研究以淮河流域某城市河道為研究對象，在了解其污染物分布特征的基礎(chǔ)上，分析了底泥中的微生物組成，并基于氮、硫轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物的分布，分別測定了厭氧氨氧化、硫酸鹽還原氨氧化、異養(yǎng)反硝化、硫自養(yǎng)反硝化和硫酸鹽還原等氮、硫轉(zhuǎn)化過程的潛力，以期為城市河道的氮、硫循環(huán)理論提供支撐，從而進一步確定城市河道的生態(tài)修復(fù)策略。

1 材料與方法

1.1 城市河道底泥概況

所選河道沿程有污水排入，所選區(qū)域段全長10.4 km，河道中主要污染物為氨氮、硝酸鹽氮、硫酸鹽、有機物等，河道沿岸均有居民，生活污水均未經(jīng)處理直接排入河流，導(dǎo)致河道常年黑臭。在該段河道沿河水流向設(shè)置了5個采樣點，采樣點位分布具體情況見本課題組之前研究[12]52。采用底泥采樣器采集表層5 cm以下的底泥樣品，帶回實驗室，分別用于微生物測序和污染物轉(zhuǎn)化速率測定。高通量測序由生工生物工程(上海)股份有限公司在Miseq平臺上完成，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增引物為341F/805R，得到的序列與Silva數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.2 轉(zhuǎn)化速率測定方法

對夏季5個采樣點的泥樣分別進行厭氧氨氧化、反硝化、硫酸鹽還原等過程的潛在轉(zhuǎn)化速率測定。所有轉(zhuǎn)化速率測定實驗均設(shè)置空白對照(CK1和CK2)，其中CK1加相同質(zhì)量的底泥，配水以純水代替，以觀察底泥內(nèi)源污染物的釋放情況；CK2只加配水，不添加底泥，以觀察在無底泥的情況下污染物是否能轉(zhuǎn)化。5個采樣點的底泥分別標為1#～5#，各實驗均進行3次，取平均值分析。

以厭氧氨氧化為例，具體步驟：取適量泥樣離心后，先用蒸餾水清洗3遍，再分別取3.0 g濕泥樣(干質(zhì)量約1.8 g)放入多個10 mL離心管內(nèi)，加入無氧水至10 mL，在暗處培養(yǎng)48 h。清洗并離心，棄去上清液，加入含有氨氮和亞硝酸鹽氮的配水，150 r/min下振蕩培養(yǎng)，模擬河道的自然波動。配水中基質(zhì)濃度根據(jù)河水水質(zhì)和實驗數(shù)據(jù)確定。根據(jù)之前的研究報道，河道上覆水、間隙水中氨氮平均值分別為23.0、173.7 mg/L[12]54，因此底泥接觸的氨氮為23.0～173.7 mg/L。此外，實驗室長期運行的序批式厭氧氨氧化反應(yīng)器證實，其最佳進水氨氮約為100 mg/L，考慮到該反應(yīng)器換水比為66%(體積分數(shù))，微生物接觸到的初始基質(zhì)質(zhì)量濃度約為66 mg/L。因此，厭氧氨氧化測定實驗中，設(shè)置氨氮為66.0 mg/L。轉(zhuǎn)化速率按照式(1)計算。所有反應(yīng)的配水中加入0.672 g/L NaHCO3、0.033 g/L KH2PO4、0.200 g/L MgSO4·7H2O、0.300 g/LCaCl2和微生物所需的微量元素。各轉(zhuǎn)化速率的配水方案見表1。

(1)

式中：v為轉(zhuǎn)化速率，mg/(g·h)；c0、c1為反應(yīng)前、后的污染物質(zhì)量濃度，mg/L；m為底泥干質(zhì)量，g；t為反應(yīng)時間，h；Q為反應(yīng)液體積，L。

1.3 分析方法

氨氮采用納氏試劑分光光度法測定，亞硝酸鹽氮采用N-1-萘基乙二胺分光光度法測定，硝酸鹽氮采用紫外分光光度法測定，硫酸鹽采用鉻酸鋇分光光度法測定[13]；硫化物按照《水質(zhì) 硫化物的測定 亞甲基藍分光光度法》(HJ 122—2021)測定。以上采用分光光度計(TU-1810)測定。COD采用COD快速消解及水質(zhì)測定儀(WWC-PC02)測定。為避免誤差，所有實驗均進行3次，并取平均值分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 底泥中的主要微生物

在門水平，相對豐度占優(yōu)勢的前10種微生物分別為變形菌門(Proteobacteria)、綠灣菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、Patescibacteria、芽單胞菌門(Rokubacteria)、Epsilonbacteraeota和疣微菌門(Verrucomicrobia)，相對豐度見表2。不同采樣點的微生物分布差異較大，但優(yōu)勢微生物在各采樣點同時存在。其中，變形菌門在5個采樣點中均占有絕對優(yōu)勢地位，相對豐度為30%左右。多種脫氮相關(guān)的微生物，如好氧氨氧化菌、硝化菌和一些反硝化菌均屬于變形菌門，能同時轉(zhuǎn)化氮、硫的脫氮硫桿菌也屬于變形菌門[14]，其較高的豐度預(yù)示著底泥中存在豐富的氮循環(huán)過程。相對豐度占據(jù)第二的綠灣菌門常存在于污泥菌膠團絮狀體內(nèi)部，并以絮體骨架的形式存在，這為底泥的團聚結(jié)構(gòu)提供了骨架支撐。第三優(yōu)勢微生物為擬桿菌門，該菌門具有非常強的營養(yǎng)代謝能力，如復(fù)雜有機物、蛋白質(zhì)和脂類等，并具有水解污泥絮體的作用。厚壁菌門則可能與有機物的降解有關(guān)。值得注意的是，不同采樣點的底泥樣品中均檢測到浮霉菌門，相對豐度為1.8%～7.3%，浮霉菌門中最具代表性的微生物為厭氧氨氧化菌，由此推測該河道底泥具有厭氧氨氧化的潛力。此外，多項研究證明，一些能同時轉(zhuǎn)化氨氮和硫酸鹽的硫酸鹽還原氨氧化菌隸屬于疣微菌門[15-16]，該菌門同樣被檢測到，因此底泥中也可能存在硫酸鹽型的厭氧氨氧化作用或具備其潛力。疣微菌門相對豐度(0.2%～1.0%)較小，這預(yù)示著硫酸鹽還原氨氧化在河道底泥氮、硫循環(huán)中的貢獻度較小。

表1 各轉(zhuǎn)化速率的配水方案Table 1 Water distribution scheme for each conversion rate

表2 河道底泥中優(yōu)勢微生物(門水平)的相對豐度Table 2 Relative abundance of dominant microorganisms (phylum level) in river sediment %

微生物測序結(jié)果表明，河道底泥中存在與異養(yǎng)反硝化、硫自養(yǎng)反硝化、厭氧氨氧化及硫酸鹽還原氨氧化等脫氮過程相關(guān)的微生物，因此分別對這幾個過程的反應(yīng)潛力進行了測定及分析。

2.2 河道底泥的反硝化潛力

反硝化包括異養(yǎng)和自養(yǎng)反硝化[17]，其中硫自養(yǎng)反硝化可將氮、硫污染物同步轉(zhuǎn)化，本研究分別測定了異養(yǎng)和硫自養(yǎng)反硝化的潛力，結(jié)果見圖1。異養(yǎng)反硝化配水中，硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、COD分別為48.1、6.8、221.5 mg/L。經(jīng)過24 h反應(yīng)后，CK1的硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、COD分別為1.2、0.4、13.9 mg/L，一般認為純水COD極低，但CK1中COD稍微升高，可能是由于純水中雜質(zhì)或測樣過程所帶來的誤差。CK2的硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、COD分別為47.2、5.2、228.6 mg/L，與配水相差不大，其中亞硝酸鹽氮從6.8 mg/L降低到5.2 mg/L，說明亞硝酸鹽氮不如硝酸鹽氮穩(wěn)定，在空氣中發(fā)生了微量的轉(zhuǎn)變；硝酸鹽氮比配水僅下降了0.9 mg/L，說明在無底泥時不能發(fā)生反硝化反應(yīng)。CK1和CK2均滿足空白對照的要求。5個采樣點底泥中，硝酸鹽氮均大幅度降低，其中4#和5#的硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均很低，幾乎完全轉(zhuǎn)化，反硝化過程進行得較徹底。1#～3#的硝酸鹽氮稍多，2#同時剩余亞硝酸鹽氮，說明其反硝化不夠徹底。采樣點底泥對COD的降解較快，剩余COD為18.4～30.5 mg/L。經(jīng)計算，采樣點的硝酸鹽氮、總氮、COD平均轉(zhuǎn)化速率分別為0.009 2、0.010 8、0.045 5 mg/(g·h)，COD去除與總氮去除的質(zhì)量比為4.2。在反硝化過程中，每轉(zhuǎn)化1 g硝酸鹽氮需要消耗2.86 g COD，而每還原1 g亞硝酸鹽氮需要消耗1.71 g COD。由此可知，底泥消耗的COD并不僅是通過反硝化去除的，有一部分可能是通過異養(yǎng)菌氧化分解。由底泥微生物組成可知，底泥中存在較多的好氧異養(yǎng)菌，可利用氧氣將COD氧化分解，這也是導(dǎo)致城市河道中DO較低的原因[4]1333。

圖1 異養(yǎng)和硫自養(yǎng)反硝化污染物轉(zhuǎn)化情況Fig.1 Conversion of pollutants in heterotrophic denitrification and sulfur-autotrophic denitrification

對于硫自養(yǎng)反硝化過程，CK1的結(jié)果正常，但CK2中硫化物在經(jīng)過24 h振蕩后降低為7.3 mg/L，這說明硫化物在空氣中即可被氧化，損失率大于50%，該現(xiàn)象在之前的研究[18-19]中也有報道。基于此進行了驗證實驗，發(fā)現(xiàn)硫化物溶液在空氣中暴露一段時間后有白色沉淀生成，推測其被氧化為單質(zhì)硫，而單質(zhì)硫可進一步被氧化為硫酸鹽，也可直接被自養(yǎng)反硝化菌利用。經(jīng)過24 h反應(yīng)后，1#～5#采樣點的硫化物分別降低至0.25、0.43、0.74、0.14、0 mg/L；硝酸鹽氮降低為12.0～14.4 mg/L，沒有亞硝酸鹽氮積累，說明硝酸鹽氮全部被轉(zhuǎn)化為氮氣排放。硝酸鹽氮、總氮的平均轉(zhuǎn)化速率均為0.001 5 mg/(g·h)，說明總氮的去除主要是通過硝酸鹽氮還原完成。硫化物的平均轉(zhuǎn)化速率為0.004 2 mg/(g·h)，但這里面包括硫化物被氧化的部分。根據(jù)報道，硫化物與硝酸鹽反應(yīng)轉(zhuǎn)化為硫酸鹽的摩爾比為0.625，單質(zhì)硫與硝酸鹽反應(yīng)轉(zhuǎn)化為硫酸鹽的摩爾比為1.1[20-22]。而本研究消耗的硫化物與硝酸鹽的平均摩爾比為1.27，遠大于上述兩個比例。這說明，配水中一部分硫化物被直接氧化為硫酸鹽，并未參與硝酸鹽氮的還原。反應(yīng)后出水中硫酸鹽約增加了50 mg/L(約0.52 mol)，而配水中的硫化物則為0.58 mol，這些結(jié)果證明硫化物最終都被轉(zhuǎn)化為硫酸鹽。若以CK2中硫化物濃度作為初始濃度計算硫化物的消耗量，則其與硝酸鹽氮消耗量的摩爾比為0.50，因此推測部分硫化物被空氣氧化成單質(zhì)硫后，進一步被反硝化菌利用。該結(jié)果證明了河道底泥具備硫自養(yǎng)反硝化的潛力，然而異養(yǎng)、硫自養(yǎng)反硝化的總氮平均轉(zhuǎn)化速率分別為0.010 8、0.001 5 mg/(g·h)，說明底泥中以異養(yǎng)反硝化為主。硫自養(yǎng)反硝化在底泥內(nèi)源污染物降解方面具有較好的應(yīng)用前景[23]，對修復(fù)黑臭河道具有重要的意義。若要實現(xiàn)硫化物和硝酸鹽的同步去除，則需要進一步強化硫自養(yǎng)反硝化過程，這是今后值得關(guān)注的重點問題。此外，河道底泥中是否存在其他轉(zhuǎn)化硫化物的過程，仍然需要進一步的深入研究。

無論是異養(yǎng)還是硫自養(yǎng)反硝化，采樣點之間的總氮去除速率相差不多，這說明在同一條河道中，即使微生物的相對豐度存在差異，但對于主要污染物的轉(zhuǎn)化潛力相差不大。在河流系統(tǒng)的氮循環(huán)中，不僅反硝化起著重要的作用，厭氧氨氧化也有重要的貢獻，因此進一步測定了底泥的厭氧氨氧化潛力。

2.3 河道底泥的厭氧氨氧化潛力

厭氧氨氧化(亞硝酸鹽型)和硫酸鹽還原氨氧化(硫酸鹽型)的測定結(jié)果見圖2。測定厭氧氨氧化潛力的3次實驗中，不同采樣點底泥對污染物的轉(zhuǎn)化有一定差異，尤其是4#和5#采樣點的氨氮消耗較少、亞硝酸鹽氮消耗較多，這有可能是發(fā)生了內(nèi)源反硝化。反硝化菌利用內(nèi)源碳源(如溶解性微生物產(chǎn)物等)，可將一部分亞硝酸鹽氮還原為氮氣[24]。2#和3#采樣點則出現(xiàn)了較明顯的硝酸鹽氮增加，雖然厭氧氨氧化反應(yīng)同樣會生成部分硝酸鹽氮，但比例較小，因此推測是由于底泥中存在硝化菌，將部分氨氮氧化為硝酸鹽氮，同時也反過來提高了氨氮轉(zhuǎn)化速率。但總體而言，各采樣點的氨氮轉(zhuǎn)化速率分布較均勻，平均轉(zhuǎn)化速率為0.003 2 mg/(g·h)；亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化速率的差異較大，平均轉(zhuǎn)化速率為0.004 0 mg/(g·h)；總氮平均轉(zhuǎn)化速率為0.007 1 mg/(g·h)，約為氨氮和亞硝酸鹽氮的平均轉(zhuǎn)化速率之和，這說明總氮的去除是通過氨氮和亞硝酸鹽氮的共同轉(zhuǎn)化而實現(xiàn)的。值得注意的是，采樣點的亞硝酸鹽氮與氨氮的平均轉(zhuǎn)化速率比為1.25，無限接近厭氧氨氧化的理論比值1.32[25]。這個結(jié)果可證實該底泥具備厭氧氨氧化的潛力，氨氮和亞硝酸鹽氮主要由厭氧氨氧化反應(yīng)去除。據(jù)報道，厭氧氨氧化對河流生態(tài)系統(tǒng)中氮素脫除的貢獻率最高達到38.7%～81.6%[26-28]，而本研究也同樣證實了其對河道底泥氮循環(huán)的重要性。

圖2 不同厭氧氨氧化途徑污染物轉(zhuǎn)化情況Fig.2 Conversion of pollutants in different anaerobic ammonia oxidation pathways

測定硫酸鹽還原氨氧化潛力的實驗中，5個采樣點氨氮和硫酸鹽的轉(zhuǎn)化速率相差不大，說明底泥中此類微生物的分布較均勻，采樣點污泥中出現(xiàn)了不同程度的亞硝酸鹽氮積累，這可能是由于氨氮被氧化導(dǎo)致的。氨氮、總氮、硫酸鹽平均轉(zhuǎn)化速率分別為0.002 5、0.002 0、0.006 9 mg/(g·h)。總氮平均轉(zhuǎn)化速率小于氨氮，這是由于底泥中一部分氨氮被好氧氨氧化菌氧化，生成了微量的亞硝酸鹽氮或硝酸鹽氮，沒有直接通過硫酸鹽還原氨氧化作用轉(zhuǎn)化為氮氣。氨氮與硫酸鹽轉(zhuǎn)化量摩爾比約為2.48，非常接近硫酸鹽還原氨氧化的理論比值2[29]。證實了底泥具備硫酸鹽還原氨氧化的潛力，存在同時將氨氮和硫酸鹽去除的可能性。

厭氧和硫酸鹽還原氨氧化的總氮平均轉(zhuǎn)化速率分別為0.007 1、0.002 0 mg/(g·h)，說明亞硝酸鹽型的厭氧氨氧化潛力遠大于硫酸鹽型。硫酸鹽還原氨氧化可同時轉(zhuǎn)化氨氮和硫酸鹽[30-31]，在河道底泥修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景，可進一步增強誘導(dǎo)硫酸鹽還原氨氧化菌的活性，來實現(xiàn)底泥中氮、硫污染物的削減。

2.4 河道底泥的硫酸鹽還原潛力

硫循環(huán)積極參與著河流生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)，除厭氧氨氧化和反硝化過程對河道底泥氮循環(huán)有重要的貢獻外，硫酸鹽還原過程由于將硫酸鹽還原為硫化氫，產(chǎn)生硫化物進而被自養(yǎng)反硝化菌利用，因而也間接參與到河道底泥的氮循環(huán)過程。硫酸鹽還原過程污染物轉(zhuǎn)化情況見圖3。配水的氨氮、硫酸鹽、COD分別為13.0、378.4、893.9 mg/L。經(jīng)過48 h反應(yīng)后，CK1的硫酸鹽、COD分別為7.3、74.1 mg/L，CK2則分別為371.1、898.4 mg/L，符合空白對照的要求。5個采樣點出水的COD和硫酸鹽均較接近，相差不大，氨氮幾乎完全被降解。氨氮、硫酸鹽、COD平均轉(zhuǎn)化速率分別為0.001 2、0.020 9、0.056 5 mg/(g·h)。硫酸鹽換算為硫元素，硫元素平均轉(zhuǎn)化速率則為0.007 0 mg/(g·h)，大于硫化物參與自養(yǎng)反硝化的轉(zhuǎn)化速率。由此推測，如果河道底泥中硫酸鹽被還原為硫化物，則可進一步參與到基于硫自養(yǎng)反硝化的氮、硫共循環(huán)體系中。

圖3 硫酸鹽還原過程污染物轉(zhuǎn)化情況Fig.3 Conversion of pollutants in sulfate reduction process

2.5 河道底泥中的氮、硫轉(zhuǎn)化途徑及應(yīng)用前景

氮、硫污染物共存是城市河道中不容忽視的問題，也是導(dǎo)致水體黑臭的主要原因。尤其是底泥內(nèi)源氮、硫的釋放，更是對其同步去除提出了要求。異養(yǎng)反硝化、硫自養(yǎng)反硝化、厭氧氨氧化、硫酸鹽還原氨氧化的總氮平均轉(zhuǎn)化速率分別為0.010 8、0.001 5、0.007 1、0.002 0 mg/(g·h)，這些過程對總氮轉(zhuǎn)化的貢獻分別為50.5%、7.0%、33.2%、9.3%，說明底泥中的氮去除主要以異養(yǎng)反硝化為主，其次為厭氧氨氧化。硫酸鹽還原氨氧化和硫自養(yǎng)反硝化這兩種有硫參與的脫氮過程對氮循環(huán)的貢獻率較低。此外，硫自養(yǎng)反硝化的硫化物、硫酸鹽還原氨氧化的硫酸鹽、硫酸鹽還原的硫酸鹽的平均轉(zhuǎn)化速率為0.004 2、0.006 9、0.020 9 mg/(g·h)，后兩者換算為硫元素的平均轉(zhuǎn)化速率分別為0.002 3、0.007 0 mg/(g·h)，可見河道底泥中的硫轉(zhuǎn)化以硫酸鹽還原為主，其次為硫自養(yǎng)反硝化。

研究中涉及的幾種氮、硫轉(zhuǎn)化途徑可互相耦合。一方面，厭氧氨氧化菌將氨氮、亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氮氣、部分硝酸鹽氮，硫自養(yǎng)反硝化菌則可將這部分硝酸鹽氮還原，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物亞硝酸鹽氮可被厭氧氨氧化菌利用，或進一步轉(zhuǎn)化為氮氣排放。另一方面，硫化物被氧化為單質(zhì)硫，或進一步轉(zhuǎn)化為硫酸鹽后被硫酸鹽還原氨氧化菌利用，該菌又將硫酸鹽轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硫。單質(zhì)硫沉淀于底泥中，也可進一步參與自養(yǎng)反硝化，從而形成了氮、硫共循環(huán)。然而，該河道底泥中硫酸鹽還原氨氧化和硫自養(yǎng)反硝化的潛力均較小，因此如要徹底解決城市河道污染問題，需要進一步強化硫酸鹽還原氨氧化或硫自養(yǎng)反硝化的潛力，從而促進氮、硫污染物的高效轉(zhuǎn)化。

3 結(jié) 論

(1) 該城市河道底泥中微生物以變形菌門為主，相對豐度為30%左右，同時包含與氮、硫循環(huán)密切相關(guān)的浮霉菌門、疣微菌門等。

(2) 該河道底泥具有反硝化、厭氧氨氧化、硫酸鹽還原等氮、硫轉(zhuǎn)化的潛力。異養(yǎng)反硝化、硫自養(yǎng)反硝化、厭氧氨氧化、硫酸鹽還原氨氧化的總氮平均轉(zhuǎn)化速率分別為0.010 8、0.001 5、0.007 1、0.002 0 mg/(g·h)，這些過程對總氮轉(zhuǎn)化的貢獻分別為50.5%、7.0%、33.2%、9.3%。

(3) 有待進一步強化底泥硫酸鹽還原氨氧化或硫自養(yǎng)反硝化的潛力，從而促進氮、硫污染物的高效轉(zhuǎn)化。