林 豪 韓 蕊 黃萍萍 徐禮斌 楊 晶 馬 雷

種植義齒具備美觀、舒適以及功能性好等優(yōu)勢，逐漸成為牙列缺損患者更青睞的選擇。種植體周圍炎是種植修復常見的并發(fā)癥[1]。最近一項Meta分析顯示歐洲和北美等區(qū)域種植體周圍炎的發(fā)生率高達22%[2]，其發(fā)生的根本原因為細菌在種植義齒周圍黏附、堆積[3，4]，牙齦卟啉單胞菌是種植體周圍炎的主要致病菌[5]。減少細菌在種植義齒表面的附著，是預防種植體周圍炎發(fā)生的關鍵[6]。

鈦為牙科種植體的最常用的材料，然而，鈦本身不具備抵抗細菌粘附的特性。因此，通過對鈦的表面改性，使細菌無法粘附在種植體表面，成為預防種植體周圍炎的研究熱點。近年來，無機納米顆粒由于其優(yōu)異的抗菌活性而受到越來越多的關注，有關銀納米粒子、二氧化硅納米粒子、氧化鋅納米粒子、鈷納米粒子等研究均較為廣泛[7-10]。納米氧化鎂作為無機納米顆粒的一種，具有制作成本低，抗菌效果優(yōu)異等優(yōu)勢[11-13]。研究證明，納米氧化鎂對革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性桿菌均有很好的抑菌作用[14，15]。

物體表面制備納米氧化鎂的方法有多種，現(xiàn)階段最常用的包括化學沉積法，溶膠-凝膠法以及磁控濺射等方法。其中，化學沉積法存在以下缺點：1.薄膜厚度難以控制；2.反應不夠徹底，溶液易造成環(huán)境污染。溶膠-凝膠法的操作及裝置較為簡單，但這一方法的主要缺陷是：樣本在制作過程中，極易發(fā)生團聚，影響樣本的質量[16]。而磁控濺射有著操作簡便、結合強度高、無污染、薄膜生長均勻致密等優(yōu)勢[17]，可以很好的彌補前兩者的缺陷。因此本實驗擬利用磁控濺射技術在純鈦表面制備不同厚度納米氧化鎂薄膜，并檢測其對牙齦卟啉單胞菌的抑菌作用。

1.材料和方法

1.1 實驗試劑99.99%氧化鎂靶材（中諾新材北京科技有限公司），維生素K、氯化血紅素、厭氧產(chǎn)氣包、BHI培養(yǎng)基、瓊脂粉（青島海博生物技術有限公司），細胞α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（BI，以色列），CCK-8試劑（MCE，美國），磷酸鹽緩沖溶液（大連美侖生物技術有限公司），0.25%胰蛋白酶、鏈霉素-青霉素雙抗（Solarbio，中國），MC3T3-E1 subclone 14小鼠前成骨細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）。

1.2 實驗設備 高真空磁控濺射薄膜沉積系統(tǒng)（中國科學院沈陽科學儀器股份有限公司），掃描電鏡（zeiss supra，德國），X射線能譜儀（Oxford，英國），原子力顯微鏡（Bruker，美國），X射線衍射儀（Bruker，德國），酶標儀（BIO-TEK，美國），CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（Wiggens，德國），電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（ICPE-9000，日本）。

1.3 樣本制作 首先制作直徑14 mm，厚3 mm的圓形鈦片，然后將各組鈦片拋光備用。采用磁控濺射技術，以純度＞99.99%的氧化鎂為靶材，以圓形鈦片為底材，將各組鈦片放入真空反應室，通入氬氣，氣壓3.5 Pa，恒溫20℃，真空度為6.0×10-5，沉積速率為1.37 nm/min。MgO-Ⅰ組沉積73 min，約100 nm厚度；MgO-Ⅱ組沉積146 min，約200 nm厚；MgO-Ⅲ組沉積218 min，約300 nm厚；拋光后不進行磁控濺射沉積的記為Ti組。

1.4 表面特征 使用掃描電鏡（SEM）觀察各組樣本表面形貌。通過X射線能譜（EDS）分析各組樣本表面元素。使用原子力顯微鏡（AFM）對各組樣本表面粗糙度進行分析。通過X射線衍射（XRD）對各組表面進行物相分析。

1.5 親水性測定 使用接觸角測量儀分別測量各組樣本三次，取平均值進行統(tǒng)計分析。接觸角的大小與親水性成反比。

1.6 鎂離子釋放 樣本在37℃的10 ml PBS中浸泡1、3、5、7、14天。同一時間點收集上清液，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測鎂離子的釋放量。

1.7 體外抗菌檢測

1.7.1 細菌培養(yǎng) 實驗選用牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，-ATCC 33277）進行抗菌性檢測，在添加了維生素K和氯化血紅素的BHI培養(yǎng)基上進行厭氧培養(yǎng)。

1.7.2 菌落計數(shù) 各組鈦片使用75%的酒精浸泡2 h，PBS沖洗，放入24孔板中，于各鈦片表面接種60 ul濃度為107CFU/ml的牙齦卟啉單胞菌菌液，培養(yǎng)24 h，PBS沖洗掉未黏附的細菌，將鈦片轉移到盛有4 ml PBS的離心管中，充分震蕩1 min，取400 ul上述液體，加入3.6 ml的PBS中，再稀釋10倍和100倍，涂布于固體培養(yǎng)基上，待細菌生長1 d，篩選合適的稀釋倍數(shù)，進行單菌落計數(shù)。

1.7.3 細菌形態(tài) 各組鈦片使用75%的酒精浸泡2 h，PBS沖洗，放入24孔板中，于各鈦片表面接種60 ul濃度為107CFU/ml的牙齦卟啉單胞菌菌液，培養(yǎng)24 h，2.5%的戊二醛固定2 h，PBS沖洗，不同濃度梯度的乙醇(30%、50%、75%、90%、95%、100%)依次脫水，掃描電鏡觀察細菌形態(tài)。

1.8 細胞毒性 采用MC3T3-E1細胞進行細胞毒性檢測。將四組樣本使用75%的酒精浸泡2 h，PBS沖洗，放入24孔板中，每孔接種4×104個MC3T3-E1細胞，放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸出孔內培養(yǎng)基，每個鈦片表面加入500 ul的培養(yǎng)基和50 ul的CCK-8試劑，避光培養(yǎng)2 h，然后吸出上述孔內的液體至96孔板中，100 ul/孔，3孔/組。使用酶標儀于波長450 nm下測量各組OD值。然后重復上述步驟測量細胞培養(yǎng)48 h、72 h后的OD值。

1.9 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析使用Graph Pad Prism軟件，采用單因素方差分析評定差異P的統(tǒng)計學意義。P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 表面特征

2.1.1 磁控濺射原理 采用磁控濺射技術，在鈦片上制備納米氧化鎂薄膜。在真空環(huán)境中，氧化鎂靶材被轟擊后生成納米氧化鎂顆粒，納米氧化鎂顆粒不斷沉積在鈦片上，最終形成連續(xù)的薄膜（圖1）。

圖1 磁控濺射工作原理

2.1.2 掃描電鏡Ti組樣本表面僅可見少量劃痕，未見雜質存在。MgO-Ⅰ表面明顯可見有薄膜覆蓋，局部薄膜出現(xiàn)裂痕，薄膜分布較均勻。MgO-Ⅱ組樣本表面薄膜無裂痕出現(xiàn)，局部可見一些氧化鎂的靶材顆粒沉積。MgO-Ⅲ組樣本表面薄膜也是清晰可見，值得一提的是，和前三組相比，MgO-Ⅲ組的樣本表面沉積了更多的氧化鎂顆粒（圖2）。

圖2 各組SEM觀察圖像

2.1.3 X射線能譜分析EDS元素含量結果分析顯示，除Ti組外，MgO-Ⅰ組、MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組表面均可檢測出鎂元素和氧元素（圖3）。

圖3 X射線能譜分析結果

2.1.4 X射線衍射Ti組和MgO-Ⅰ組僅見Ti的衍射峰，MgO-Ⅱ和MgO-Ⅲ組表面除Ti的衍射峰外，MgO的衍射峰也開始出現(xiàn)，并且部分Ti的衍射峰消失（圖4）。

圖4 各組X射線衍射結果

2.1.5 粗糙度Ti組，MgO-Ⅰ組，MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組的RA分別為（39.07±2.8 nm）、（49.93±3.89 nm）、（70.4±4.73 nm）、（78.23±3.84 nm），表明隨納米氧化鎂薄膜厚度的增加，樣本表面的粗糙度也在增加。與Ti組相比，實驗組的粗糙度顯著增加(P＜0.05)。與MgO-Ⅰ組相比，MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組兩者的粗糙度也有顯著增加（P＜0.001）。MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組兩者相比，樣本表面粗糙度無差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 各組原子力顯微鏡圖像及粗糙度

2.1.6 親水性Ti組表面的水接觸角最大，為（56.82±2.66）。MgO-Ⅰ組和MgO-Ⅱ組表面的水接觸角有所減小，分別是（37.83±0.59）和（36.42±0.67），而MgO-Ⅲ組表面的水接觸角最小，是（28.44±1.48）。Ti組與實驗組相比，水接觸角明顯增大（P＜0.05），表明Ti組的親水性最差。MgO-Ⅰ組和MgO-Ⅱ組之間的水接觸角變化不明顯（P＞0.05）。MgO-Ⅲ組與其余三組相比，其表面的水接觸角最?。≒＜0.05），表明MgO-Ⅲ組的親水性都要好（圖6）。

圖6 各樣本表面水接觸角代表性圖像及接觸角數(shù)值統(tǒng)計學分析

2.1.7 鎂離子釋放MgO-Ⅰ組、MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組表面的鎂離子在第一天都獲得了爆發(fā)性釋放，各組初期的釋放速度較快，隨著時間的推移，釋放速度逐漸減慢。第三天，MgO-Ⅰ組鎂離子釋放開始減少，基本消失不見。MgO-Ⅱ組鎂離子的釋放持續(xù)到第5 d才開始變得緩慢，后續(xù)仍有少量鎂離子釋放。MgO-Ⅲ組鎂離子一直持續(xù)釋放，在7-14 d，仍可檢測到鎂離子的釋放（圖7）。

圖7 MgO?I、MgO?Ⅱ、MgO?Ⅲ鎂離子釋放曲線

2.2 體外抗菌活性

2.2.1 菌落計數(shù)Ti組表面的牙齦卟啉單胞菌可以正常生長，而其余覆蓋納米氧化鎂薄膜的三組，樣本表面牙齦卟啉單胞菌的生長均受到抑制，并且隨著薄膜厚度的增加，菌落數(shù)也逐漸減少。MgO-Ⅰ組對牙齦卟啉單胞菌的平均抑菌率達78.14%，MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組的平均抑菌率更高，分別為87.16%和99.86%。各組之間的平均抑菌率，存在明顯差異（P＜0.001）（圖8）。

圖8 各組對牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果及抗菌率

2.2.2 細菌形態(tài)Ti表面，細菌形態(tài)完整，細菌生長良好，MgO-Ⅰ組表面出現(xiàn)破裂的細菌，兩者之間的數(shù)量無明顯差異。MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組表面的細菌數(shù)量明顯減少，且大部分細菌出現(xiàn)破裂，無完整結構（圖9）。

圖9 各組掃描電鏡下的細菌形態(tài)

2.3 細胞毒性實驗 使用MC3T3-E1細胞進行細胞毒性檢測，分別測試24 h、48 h和72 h三個時間段的細胞存活率，各組細胞存活率無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），表明三種厚度的納米氧化鎂薄膜均無細胞毒性（圖10）。

圖10 各組樣本表面培養(yǎng)MC3T3?E1細胞不同時間點的細胞活性

3.討論

隨著種植義齒的廣泛應用，種植體周圍炎的發(fā)病率也逐漸增加[18，19]。為了減少種植體周圍炎的發(fā)生，人們不斷進行著探索和研究，其中表面改性是一大熱點?，F(xiàn)有的抗菌涂層，都或多或少的存在各種缺陷，例如，抗菌肽(AMPs)的穩(wěn)定性差[20]，銀等金屬離子存在細胞毒性[21]，TiO2需要光照發(fā)揮抗菌效果等。因此，人們一直致力于開發(fā)一種簡便、安全、有效的涂層。

納米氧化鎂具有制作簡單、價格低廉、抗菌效果優(yōu)異等優(yōu)點，研究證明其對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有一個良好的抗菌活性[22，23]。因此，納米氧化鎂涂層可解決當前涂層存在的多種弊端。作為物理氣相沉積的一種方式，磁控濺射操作簡便，薄膜與底材的結合強度高，無污染，所生成的薄膜致密[17]。基于上述考慮，本研究選用磁控濺射技術，制備了不同厚度的納米氧化鎂薄膜，探索其對牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果。種植體表面改性涂層的結合強度對于涂層發(fā)揮長期的生物學作用具有重要影響。但遺憾的是，目前并沒有較為可靠準確的方法來測量涂層與鈦表面的結合強度。先前研究表明，通過磁控濺射法在鈦的表面上形成的羥基磷灰石涂層的拉伸粘結強度可達80MPa[24]。趙玉濤等人借助磁控濺射技術在鈦表面制備了HA/YSZ（釔穩(wěn)定氧化鋯，Yt-tria stabilized zirconia）生物梯度涂層，通過檢測得出鈦與該涂層之間結合強度可達60 MPa[25]。因此，我們認為通過磁控濺射在鈦表面形成的涂層是穩(wěn)定可靠的。

實驗結果表明，厚度約100 nm的薄膜已具備良好抑菌效果且隨薄膜厚度的增加，其抗菌效果也會增強，當薄膜厚度達到約300 nm時，牙齦卟啉單胞菌基本無法在其表面存活。由此可見，通過控制納米氧化鎂薄膜的厚度，可獲得理想的抗菌效果。此外，觀察掃描電鏡下的細菌形態(tài)顯示，除Ti外，另外三組均出現(xiàn)破碎的細菌，并且MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組表面的細菌數(shù)量明顯減少。由此可得出結論，納米氧化鎂薄膜不僅可以抑制牙齦卟啉單胞菌的生長，還可破壞細菌的結構。

目前納米氧化鎂的抗菌機制尚未明確，大部分研究人員認為納米氧化鎂的抗菌機制與活性氧（reactive oxygen species，ROS）損傷有關。溶液中存在的O2在納米氧化鎂的催化作用下發(fā)生還原反應，產(chǎn)生的超氧陰離子自由基O2-可以破壞細胞膜壁，從而殺死細菌[26]。Hewitt提出納米氧化鎂催化O2發(fā)生催化反應，依靠的是其表面存在的氧空位，進一步導致脂質過氧化和ROS的產(chǎn)生[27]。此外，納米氧化鎂與水反應生成Mg(OH)2，形成的堿性環(huán)境可以為O2-提供更加穩(wěn)定的一個環(huán)境，提高殺菌效果[28]。

然而，Leung[29]制作了三組不同的納米氧化鎂，發(fā)現(xiàn)三組納米氧化鎂對大腸桿菌均有良好的抗菌效果，但只有一組納米氧化鎂可以檢測出ROS，因此提出納米氧化鎂可能通過與細菌接觸，改變細胞膜周圍PH值，或者釋放Mg2+，來破壞細菌結構，以達到抗菌效果。此外，Yamamoto[30]等也通過實驗發(fā)現(xiàn)，納米氧化鎂除引起氧化損傷外，也可吸附到細菌表面，破壞細菌結構。納米氧化鎂的尺寸小，比表面積大，可以更好的與細菌相接觸。綜上所述，關于納米氧化鎂的抗菌機制，仍存在爭議，還有待進一步研究。

本實驗中，實驗組和對照組對牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果存在差異，也與納米氧化鎂薄膜表面親水性較強有關。因為疏水利于細菌在物體表面黏附[31]，其可能由于蛋白質的吸附作用及細菌與疏水表面的相互作用。同時，Yang等人通過實驗發(fā)現(xiàn)，比起疏水表面，人骨髓間充質干細胞更易黏附于親水的表面[32]。這對于種植義齒修復的臨床治療，是非常有利的。

樣本的粗糙度也是本次實驗需要關注的一項物理特征，因為粗糙度和細菌黏附也有密切的關系。研究表明，粗糙物體的表面比光滑物體更容易引起細菌的黏附[33]。為進一步研究粗糙度對細菌黏附的影響，Bollen CML制作了普通機械加工處理的鈦的基臺和高度拋光的陶瓷基臺，并通過比較兩者表面的口腔多種微生物的黏附數(shù)量，提出了一個影響細菌黏附的粗糙度的精準閾值，當粗糙度大于200 nm時，會使細菌黏附增加[34]。本研究中，實驗組因為表面納米氧化鎂顆粒的存在，粗糙度比起對照組均有所增加，但各組的Ra值都遠低于200 nm，所以納米氧化鎂顆粒導致的粗糙度增加并不會影響細菌的黏附。

4.結論

在本研究中，通過在鈦表面制備不同厚度的納米氧化鎂薄膜，有效地抑制了牙齦卟啉單胞菌的生長。實驗結果表明，納米氧化鎂有望用于種植義齒表面，預防種植體周圍炎的發(fā)生。本研究尚存在不足之處：⑴關于納米氧化鎂對牙齦卟啉單胞菌的確切抗菌機制還有待進一步探究；⑵納米氧化鎂薄膜對鈦的機械強度的是否會有影響，以及材料在口腔內長期存在后薄膜的結合強度是否會改變仍有待于進一步研究。我們相信，隨著材料的發(fā)展和技術的進步，納米氧化鎂有望成為各領域中常用的抗菌材料。