千金藤素通過(guò)調(diào)控p53信號(hào)介導(dǎo)的自噬逆轉(zhuǎn)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的?？颂婺崮退幮?/h1>
2022-04-26 06:43:14劉然邢爽王璐張怡許保海
臨床肺科雜志 2022年5期
劉然 邢爽 王璐 張怡 許保海
非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見(jiàn)的肺癌形式，約占所有肺癌病例的85%，其五年生存率很低，僅為15%[1-2]。化學(xué)療法和靶向療法顯著改善了患者的預(yù)后。然而，當(dāng)癌細(xì)胞對(duì)藥物治療產(chǎn)生抗藥性時(shí)，一些患者會(huì)復(fù)發(fā)，這代表了重要的臨床局限性[3-4]。?？颂婺?Icotinib)是第一代表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)-酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)，具有方便、高效、低毒的特點(diǎn)[5-6]，已被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(CDFA)批準(zhǔn)為激活EGFR突變的NSCLC患者的一線(xiàn)治療藥物，但是幾乎所有接受治療的患者經(jīng)過(guò)9～15個(gè)月無(wú)進(jìn)展生存期后，都不可避免地出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致治療失敗[7]。因此，深入探討EGFR-TKI耐藥肺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，對(duì)于探索新的耐藥逆轉(zhuǎn)策略具有重要意義。千金藤素(Cepharanthine)是從中藥千金藤中提取的異喹啉生物堿，臨床主要用于白細(xì)胞減少癥，研究表明千金藤素在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性和抗多藥耐藥的作用；可誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞活力[8]；能逆轉(zhuǎn)人鼻咽癌多藥耐藥細(xì)胞CNE2/ADM的耐藥性[9]；與多柔比星聯(lián)合應(yīng)用能逆轉(zhuǎn)人類(lèi)髓性白血病細(xì)胞K562/ADR對(duì)多柔比星耐藥性[10]。但是千金藤素能否逆轉(zhuǎn)人NSCLC細(xì)胞的?？颂婺崮退幮赃€未可知，因此本研究旨在探討千金藤素對(duì)人NSCLC細(xì)胞的埃克替尼耐藥性的影響及可能的作用機(jī)制。
資料與方法
一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
人NSCLC細(xì)胞PC-9(ATCC)購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，貨號(hào)：DA-C5037。
二、藥物、儀器與試劑
胎牛血清(10099-141)、DMEM培養(yǎng)基(10569-010)(美國(guó)Gibco公司)，埃克替尼(浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20110061)，Pifithrin-α(PFT-α，p53抑制劑，上海信裕生物科技有限公司，貨號(hào)：XY-1816)，MTT試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)(碧云天生物科技公司)，6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：M9281)；細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)(南京森貝伽生物公司，貨號(hào)：SBJ-1661)，兔抗人p53(ab32389)、mTOR(ab32028)、p-mTOR(ab137133)、Beclin-1(ab207612)、LC3A/B(ab128025)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)(英國(guó)abcam公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，IX73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，H-7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)，iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。
三、細(xì)胞培養(yǎng)及NSCLC埃克替尼耐藥細(xì)胞PC-9/Icotinib resistance(IR)的建立
采用?？颂婺釢舛冗f增、不斷作用的方式誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞耐藥。PC-9細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.5 μmol/L的?？颂婺岽碳ぷ饔?4 h，然后換新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)到正常生長(zhǎng)狀態(tài)，長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后進(jìn)行傳代，再用0.5 μmol/L的?？颂婺嶙饔?4h，反復(fù)換液、傳代，直至在同一濃度藥物作用下細(xì)胞生長(zhǎng)不受影響，逐漸增加埃克替尼濃度進(jìn)行不斷篩選培養(yǎng)，直至PC-9細(xì)胞能在含濃度為20 μmol/L埃克替尼的培養(yǎng)基中穩(wěn)定存活，記為PC-9/IR耐藥細(xì)胞。
四、MTT法篩選千金藤素的實(shí)驗(yàn)濃度
體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所使用的千金藤素的濃度，以對(duì)PC-9/IR細(xì)胞不造成顯著生長(zhǎng)抑制為標(biāo)準(zhǔn)，取該濃度范圍內(nèi)的較高濃度為千金藤素濃度。具體操作為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9/IR耐藥細(xì)胞，以2×103細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔板中(邊緣孔用PBS填充)，待PC-9/IR耐藥細(xì)胞貼壁并鋪滿(mǎn)孔底后，棄去原培養(yǎng)基，加入含2、4、8、16、32 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后加入5 g/L MTT試劑20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上層清液后加入150μl的DMSO低速震蕩溶解10min；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在490 nm處的光密度(optic density，OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。將不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。
細(xì)胞增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD-空白對(duì)照組OD)/(對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD)×100%
五、?？颂婺崦舾行詸z測(cè)
采用MTT法檢測(cè)：具體操作同1.2.2，固定千金藤素的濃度為8 μmol/L，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9/IR耐藥細(xì)胞接種到96孔板中，待PC-9/IR耐藥細(xì)胞貼壁并鋪滿(mǎn)孔底后，分組兩組：一組只用含0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L埃克替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)，不使用千金藤素；一組用含8 μmol/L千金藤素和不同濃度(0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)的埃克替尼的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h后，各孔加入5 g/L MTT試劑20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后加入150μL的DMSO；在490 nm處測(cè)定各組細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率；并采用GraphPad軟件計(jì)算?？颂婺釋?duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(the half inhibitory concentration, IC50)和逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)(reverse fold, RF)=IR IC50/(IR+千金藤素)共同作用下IC50。
細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白對(duì)照組OD)/(對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD)×100%
六、細(xì)胞分組及處理
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9/IR耐藥細(xì)胞，按每孔2×106個(gè)接種于24孔板，分PC-9/IR組(正常培養(yǎng)的PC-9/IR耐藥細(xì)胞)、千金藤素組(PC-9/IR耐藥細(xì)胞+8 μmol/L千金藤素)、?？颂婺峤M(PC-9/IR耐藥細(xì)胞+20 μmol/L?？颂婺?、千金藤素+?？颂婺峤M(PC-9/IR耐藥細(xì)胞用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)、3-MA組(PC-9/IR耐藥細(xì)胞用5 mmol/L的3-MA預(yù)處理1 h，隨后用含20 μmol/L?？颂婺岷? μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)、PFT-α組(PC-9/IR耐藥細(xì)胞用40μmol/L的p53抑制劑Pifithrin-α預(yù)處理1 h再用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
七、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的PC-9/IR細(xì)胞，按照1.2.4項(xiàng)下步驟進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，離心，去除上清液，PBS洗滌后將細(xì)胞以1×106細(xì)胞/mL的密度重懸，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI避光孵育15 min，按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。
八、MDC染色檢測(cè)自噬
MDC是一種嗜酸性熒光染色劑，可選擇性標(biāo)記酸性自噬泡，通常用作檢測(cè)自噬的特異性標(biāo)記。細(xì)胞按照1.2.4項(xiàng)下步驟進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48h后，用MDC(50 μmol/L)在37℃下避光孵育15 min，PBS洗滌兩次，立即使用倒置熒光顯微鏡檢測(cè)并拍照。平均光密度值由Image-Pro Plus 6.0版計(jì)算得出。
九、透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化
收集各組細(xì)胞并用PBS洗滌，然后立即浸入2.5%戊二醛中在4°C下固定30 mim。將樣品后固定在1%四氧化鋨中1h，然后在一系列梯度乙醇中脫水。切超薄切片(50nm)，用2.5%乙酸鈾酰和1%檸檬酸鉛染色。用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬情況，并拍照。
十、Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)
使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中蛋白質(zhì)。使用BCA試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。取等量蛋白質(zhì)樣品上樣(30 μg/泳道)，10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并通過(guò)半干轉(zhuǎn)移將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下與一抗(p53、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3A/B、β-actin，1∶1000)孵育過(guò)夜。第二天，將膜與偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h，然后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)進(jìn)行顯色。以β-actin為內(nèi)參，分析結(jié)果。
十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
結(jié) 果
一、千金藤素的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)濃度
不同濃度的千金藤素能不同程度的抑制PC-9/IR細(xì)胞的生長(zhǎng)(見(jiàn)表1)；千金藤素的濃度在2、4、8 μmol/L時(shí)對(duì)PC-9/IR細(xì)胞的抑制作用較弱，抑制率均低于5%。因此，選擇8 μmol/L的千金藤素作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。
表1 千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞增殖的抑制作用
二、千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞埃克替尼敏感性的作用
PC-9/IR細(xì)胞的存活率隨著?？颂婺釢舛鹊脑黾佣档停Ы鹛偎啬苊黠@增加PC-9/IR細(xì)胞對(duì)?？颂婺岬拿舾行裕?jīng)計(jì)算使用千金藤素后PC-9/IR細(xì)胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆轉(zhuǎn)耐藥指數(shù)為10.11倍(見(jiàn)表2、圖1)。為了保證細(xì)胞的存活率，故選擇?？颂婺釢舛葹? μmol/L與8 μmol/L千金藤素共同處理PC-9/IR細(xì)胞。
表2 千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞?？颂婺崦舾行缘淖饔?/p>
圖1 千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞埃克替尼敏感性的作用
三、千金藤素聯(lián)合?？颂婺釋?duì)PC-9/IR細(xì)胞凋亡的作用
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與單用千金藤素組和?？颂婺峤M相比，千金藤素+?？颂婺峤M細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與千金藤素+?？颂婺峤M相比，3-MA組、PFT-α組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；見(jiàn)(圖2、表3)。
圖2 各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果
表3 各組細(xì)胞凋亡率的比較
四、千金藤素聯(lián)合?？颂婺釋?duì)PC-9/IR細(xì)胞中自噬的影響
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細(xì)胞綠色熒光的平均光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與千金藤素組和埃克替尼組相比，千金藤素+?？颂婺峤M細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)和核周區(qū)顯示出綠點(diǎn)樣結(jié)構(gòu)的增加，其代表成熟的自噬空泡，平均光密度顯著增加(P<0.05)；與千金藤素+?？颂婺峤M相比，3-MA組、PFT-α組綠色熒光的平均光密度明顯降低(P<0.05)；見(jiàn)(圖3、表4)。
圖3 各組細(xì)胞MDC染色結(jié)果(200×，400×)
表4 各組細(xì)胞自噬的自噬情況比較
五、各組細(xì)胞中自噬小體的形成情況
PC-9/IR組細(xì)胞顯示正常的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞器，沒(méi)有自噬小體；千金藤素組和?？颂婺峤M可見(jiàn)少量具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體形成；千金藤素+埃克替尼組細(xì)胞中可見(jiàn)較多的自噬小體，某些自噬小體的液泡內(nèi)還包含受損的細(xì)胞器，如線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；3-MA組和PFT-α組細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量較千金藤素+?？颂婺峤M明顯減少(見(jiàn)圖4)。
圖4 各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化(TEM，53000×)
六、各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與千金藤素組和?？颂婺峤M相比，千金藤素+?？颂婺峤M細(xì)胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)顯著增加，p-mTOR/mTOR的比值顯著降低(P<0.05)；與千金藤素+?？颂婺峤M相比，3-MA組、PFT-α組細(xì)胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)明顯降低，p-mTOR/mTOR的比值明顯升高(P<0.05)(見(jiàn)圖5，表5)。
圖5 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)
討 論
癌癥耐藥性是臨床治療中治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，克服癌細(xì)胞的耐藥性已成為癌癥治療領(lǐng)域要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)EGFR-TKI具有高度抵抗力的細(xì)胞中，自噬并沒(méi)有被上調(diào)，而這些細(xì)胞與雷帕霉素(一種自噬的誘導(dǎo)劑)共同處理可以部分恢復(fù)對(duì)EGFR-TKI的敏感性[11]。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能通過(guò)誘導(dǎo)自噬逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞的吉非替尼耐藥性；YM155(一種survivin小分子抑制劑)可通過(guò)誘導(dǎo)自噬顯著增強(qiáng)厄洛替尼對(duì)EGFR-TKI耐藥的NSCLC細(xì)胞系H1650和A549的敏感性[13]。表明自噬的誘導(dǎo)可能是恢復(fù)對(duì)EGFR-TKI耐藥細(xì)胞敏感性的有效策略。
千金藤素在臨床主要用于白細(xì)胞減少癥，近年的研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性有逆轉(zhuǎn)作用，如鼻咽癌多藥耐藥細(xì)胞CNE2/ADM、人類(lèi)髓性白血病多柔比星耐藥細(xì)胞K562/ADR；并且其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響與自噬密切相關(guān)[14]。項(xiàng)福英等[8]發(fā)現(xiàn)千金藤素可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路，增加SKOV3細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡數(shù)量，誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬；張巖昊等[15]發(fā)現(xiàn)千金藤素能誘導(dǎo)線(xiàn)粒體自噬的增加，增強(qiáng)多柔比星抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖的活性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究采用體外濃度梯度遞增的方法建立NSCLC細(xì)胞PC-9的?？颂婺崮退幖?xì)胞株P(guān)C-9/IR，從自噬的角度考察千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞耐藥性的作用；首先我們?cè)诩?xì)胞水平篩選千金藤素作用于PC-9/IR細(xì)胞的濃度，通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)千金藤素的濃度低于8 μmol/L時(shí)對(duì)PC-9/IR細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的抑制作用(抑制率<5%)，因此選擇此濃度作為后續(xù)耐藥性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中千金藤素的濃度。隨后我們將低毒劑量的千金藤素與不同濃度的?？颂婺峁餐饔糜赑C-9/IR細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞增殖情況來(lái)評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥后PC-9/IR細(xì)胞對(duì)?？颂婺崦舾行缘淖兓?，發(fā)現(xiàn)千金藤素與?？颂婺崧?lián)合用藥后，相比?？颂婺釂为?dú)用藥，PC-9/IR細(xì)胞的存活率顯著降低，PC-9/IR細(xì)胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆轉(zhuǎn)耐藥指數(shù)為10.11倍，說(shuō)明千金藤素能逆轉(zhuǎn)PC-9/IR細(xì)胞的埃克替尼耐藥性。為了進(jìn)一步探究千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞的埃克替尼耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用是否與自噬相關(guān)，我們采用透射電子顯微鏡和MDC染色觀察細(xì)胞自噬情況，發(fā)現(xiàn)千金藤素與?？颂婺崧?lián)合應(yīng)用可顯著增加PC-9/IR細(xì)胞中自噬空泡和自噬小體的數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而經(jīng)過(guò)自噬抑制劑3-MA預(yù)處理的PC-9/IR細(xì)胞，自噬空泡和自噬小體的數(shù)量均減少，能降低千金藤素與?？颂婺崧?lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)PC-9/IR細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；提示千金藤素逆轉(zhuǎn)PC-9/IR細(xì)胞的?？颂婺崮退幮耘c促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。但其具體通過(guò)何種途徑發(fā)揮作用，尚不清楚。
近年來(lái)研究表明，抑癌基因p53作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期阻滯、凋亡中都發(fā)揮著重要作用；并且參與自噬活性的調(diào)節(jié)。約50%的晚期NSCLC病例中發(fā)生p53突變，導(dǎo)致腫瘤抑制功能喪失。重新激活突變型p53，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是p53靶向治療的目標(biāo)[16]。NSCLC組織中p53表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)[17]。Fan等[18]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過(guò)p53介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)NSCLC A549細(xì)胞凋亡和自噬；黃芩苷能通過(guò)激活p53途徑提高順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬以克服NSCLC的順鉑耐藥性[19]；重樓皂苷可上調(diào)p53，誘導(dǎo)caspase依賴(lài)性凋亡，并抑制mTOR信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制抗順鉑的人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)異喹啉生物堿(包括千金藤素)是一種新型的AMPK激活劑可誘導(dǎo)耐藥性癌癥中的自噬細(xì)胞死亡[21]；Unson等[22]發(fā)現(xiàn)千金藤素是用于治療具有p53突變的結(jié)直腸癌患者的有前途的藥物；而且能夠上調(diào)p53蛋白表達(dá)，抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，千金藤素與埃克替尼聯(lián)合作用于PC-9/IR細(xì)胞時(shí)，可上調(diào)p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)，并抑制p-mTOR的表達(dá)，使用3-MA預(yù)處理的PC-9/IR細(xì)胞中p53的表達(dá)降低，而且p53抑制劑Pifithrin-α可減少千金藤素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬；提示千金藤素可能通過(guò)上調(diào)p53的表達(dá)，誘導(dǎo)PC-9/IR細(xì)胞自噬，促進(jìn)其凋亡。
綜上所述，千金藤素可能通過(guò)激活p53介導(dǎo)的自噬，逆轉(zhuǎn)PC-9/IR細(xì)胞的?？颂婺崮退幮浴Ｓ捎趐53在自噬中的調(diào)控比較復(fù)雜，其對(duì)自噬的調(diào)控作用受細(xì)胞所處的環(huán)境和所受的壓力及其亞細(xì)胞定位的影響，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
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劉然 邢爽 王璐 張怡 許保海
非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見(jiàn)的肺癌形式，約占所有肺癌病例的85%，其五年生存率很低，僅為15%[1-2]。化學(xué)療法和靶向療法顯著改善了患者的預(yù)后。然而，當(dāng)癌細(xì)胞對(duì)藥物治療產(chǎn)生抗藥性時(shí)，一些患者會(huì)復(fù)發(fā)，這代表了重要的臨床局限性[3-4]。?？颂婺?Icotinib)是第一代表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)-酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)，具有方便、高效、低毒的特點(diǎn)[5-6]，已被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(CDFA)批準(zhǔn)為激活EGFR突變的NSCLC患者的一線(xiàn)治療藥物，但是幾乎所有接受治療的患者經(jīng)過(guò)9～15個(gè)月無(wú)進(jìn)展生存期后，都不可避免地出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致治療失敗[7]。因此，深入探討EGFR-TKI耐藥肺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，對(duì)于探索新的耐藥逆轉(zhuǎn)策略具有重要意義。千金藤素(Cepharanthine)是從中藥千金藤中提取的異喹啉生物堿，臨床主要用于白細(xì)胞減少癥，研究表明千金藤素在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性和抗多藥耐藥的作用；可誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞活力[8]；能逆轉(zhuǎn)人鼻咽癌多藥耐藥細(xì)胞CNE2/ADM的耐藥性[9]；與多柔比星聯(lián)合應(yīng)用能逆轉(zhuǎn)人類(lèi)髓性白血病細(xì)胞K562/ADR對(duì)多柔比星耐藥性[10]。但是千金藤素能否逆轉(zhuǎn)人NSCLC細(xì)胞的?？颂婺崮退幮赃€未可知，因此本研究旨在探討千金藤素對(duì)人NSCLC細(xì)胞的埃克替尼耐藥性的影響及可能的作用機(jī)制。
資料與方法
一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
人NSCLC細(xì)胞PC-9(ATCC)購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，貨號(hào)：DA-C5037。
二、藥物、儀器與試劑
胎牛血清(10099-141)、DMEM培養(yǎng)基(10569-010)(美國(guó)Gibco公司)，埃克替尼(浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20110061)，Pifithrin-α(PFT-α，p53抑制劑，上海信裕生物科技有限公司，貨號(hào)：XY-1816)，MTT試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)(碧云天生物科技公司)，6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：M9281)；細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)(南京森貝伽生物公司，貨號(hào)：SBJ-1661)，兔抗人p53(ab32389)、mTOR(ab32028)、p-mTOR(ab137133)、Beclin-1(ab207612)、LC3A/B(ab128025)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)(英國(guó)abcam公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，IX73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，H-7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)，iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。
三、細(xì)胞培養(yǎng)及NSCLC埃克替尼耐藥細(xì)胞PC-9/Icotinib resistance(IR)的建立
采用?？颂婺釢舛冗f增、不斷作用的方式誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞耐藥。PC-9細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.5 μmol/L的?？颂婺岽碳ぷ饔?4 h，然后換新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)到正常生長(zhǎng)狀態(tài)，長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后進(jìn)行傳代，再用0.5 μmol/L的?？颂婺嶙饔?4h，反復(fù)換液、傳代，直至在同一濃度藥物作用下細(xì)胞生長(zhǎng)不受影響，逐漸增加埃克替尼濃度進(jìn)行不斷篩選培養(yǎng)，直至PC-9細(xì)胞能在含濃度為20 μmol/L埃克替尼的培養(yǎng)基中穩(wěn)定存活，記為PC-9/IR耐藥細(xì)胞。
四、MTT法篩選千金藤素的實(shí)驗(yàn)濃度
體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所使用的千金藤素的濃度，以對(duì)PC-9/IR細(xì)胞不造成顯著生長(zhǎng)抑制為標(biāo)準(zhǔn)，取該濃度范圍內(nèi)的較高濃度為千金藤素濃度。具體操作為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9/IR耐藥細(xì)胞，以2×103細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔板中(邊緣孔用PBS填充)，待PC-9/IR耐藥細(xì)胞貼壁并鋪滿(mǎn)孔底后，棄去原培養(yǎng)基，加入含2、4、8、16、32 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后加入5 g/L MTT試劑20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上層清液后加入150μl的DMSO低速震蕩溶解10min；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在490 nm處的光密度(optic density，OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。將不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。
細(xì)胞增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD-空白對(duì)照組OD)/(對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD)×100%
五、?？颂婺崦舾行詸z測(cè)
采用MTT法檢測(cè)：具體操作同1.2.2，固定千金藤素的濃度為8 μmol/L，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9/IR耐藥細(xì)胞接種到96孔板中，待PC-9/IR耐藥細(xì)胞貼壁并鋪滿(mǎn)孔底后，分組兩組：一組只用含0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L埃克替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)，不使用千金藤素；一組用含8 μmol/L千金藤素和不同濃度(0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)的埃克替尼的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h后，各孔加入5 g/L MTT試劑20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后加入150μL的DMSO；在490 nm處測(cè)定各組細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率；并采用GraphPad軟件計(jì)算?？颂婺釋?duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(the half inhibitory concentration, IC50)和逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)(reverse fold, RF)=IR IC50/(IR+千金藤素)共同作用下IC50。
細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白對(duì)照組OD)/(對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD)×100%
六、細(xì)胞分組及處理
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9/IR耐藥細(xì)胞，按每孔2×106個(gè)接種于24孔板，分PC-9/IR組(正常培養(yǎng)的PC-9/IR耐藥細(xì)胞)、千金藤素組(PC-9/IR耐藥細(xì)胞+8 μmol/L千金藤素)、?？颂婺峤M(PC-9/IR耐藥細(xì)胞+20 μmol/L?？颂婺?、千金藤素+?？颂婺峤M(PC-9/IR耐藥細(xì)胞用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)、3-MA組(PC-9/IR耐藥細(xì)胞用5 mmol/L的3-MA預(yù)處理1 h，隨后用含20 μmol/L?？颂婺岷? μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)、PFT-α組(PC-9/IR耐藥細(xì)胞用40μmol/L的p53抑制劑Pifithrin-α預(yù)處理1 h再用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
七、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的PC-9/IR細(xì)胞，按照1.2.4項(xiàng)下步驟進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，離心，去除上清液，PBS洗滌后將細(xì)胞以1×106細(xì)胞/mL的密度重懸，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI避光孵育15 min，按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。
八、MDC染色檢測(cè)自噬
MDC是一種嗜酸性熒光染色劑，可選擇性標(biāo)記酸性自噬泡，通常用作檢測(cè)自噬的特異性標(biāo)記。細(xì)胞按照1.2.4項(xiàng)下步驟進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48h后，用MDC(50 μmol/L)在37℃下避光孵育15 min，PBS洗滌兩次，立即使用倒置熒光顯微鏡檢測(cè)并拍照。平均光密度值由Image-Pro Plus 6.0版計(jì)算得出。
九、透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化
收集各組細(xì)胞并用PBS洗滌，然后立即浸入2.5%戊二醛中在4°C下固定30 mim。將樣品后固定在1%四氧化鋨中1h，然后在一系列梯度乙醇中脫水。切超薄切片(50nm)，用2.5%乙酸鈾酰和1%檸檬酸鉛染色。用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬情況，并拍照。
十、Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)
使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中蛋白質(zhì)。使用BCA試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。取等量蛋白質(zhì)樣品上樣(30 μg/泳道)，10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并通過(guò)半干轉(zhuǎn)移將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下與一抗(p53、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3A/B、β-actin，1∶1000)孵育過(guò)夜。第二天，將膜與偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h，然后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)進(jìn)行顯色。以β-actin為內(nèi)參，分析結(jié)果。
十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
結(jié) 果
一、千金藤素的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)濃度
不同濃度的千金藤素能不同程度的抑制PC-9/IR細(xì)胞的生長(zhǎng)(見(jiàn)表1)；千金藤素的濃度在2、4、8 μmol/L時(shí)對(duì)PC-9/IR細(xì)胞的抑制作用較弱，抑制率均低于5%。因此，選擇8 μmol/L的千金藤素作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。
表1 千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞增殖的抑制作用
二、千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞埃克替尼敏感性的作用
PC-9/IR細(xì)胞的存活率隨著?？颂婺釢舛鹊脑黾佣档停Ы鹛偎啬苊黠@增加PC-9/IR細(xì)胞對(duì)?？颂婺岬拿舾行裕?jīng)計(jì)算使用千金藤素后PC-9/IR細(xì)胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆轉(zhuǎn)耐藥指數(shù)為10.11倍(見(jiàn)表2、圖1)。為了保證細(xì)胞的存活率，故選擇?？颂婺釢舛葹? μmol/L與8 μmol/L千金藤素共同處理PC-9/IR細(xì)胞。
表2 千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞?？颂婺崦舾行缘淖饔?/p>
圖1 千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞埃克替尼敏感性的作用
三、千金藤素聯(lián)合?？颂婺釋?duì)PC-9/IR細(xì)胞凋亡的作用
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與單用千金藤素組和?？颂婺峤M相比，千金藤素+?？颂婺峤M細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與千金藤素+?？颂婺峤M相比，3-MA組、PFT-α組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；見(jiàn)(圖2、表3)。
圖2 各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果
表3 各組細(xì)胞凋亡率的比較
四、千金藤素聯(lián)合?？颂婺釋?duì)PC-9/IR細(xì)胞中自噬的影響
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細(xì)胞綠色熒光的平均光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與千金藤素組和埃克替尼組相比，千金藤素+?？颂婺峤M細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)和核周區(qū)顯示出綠點(diǎn)樣結(jié)構(gòu)的增加，其代表成熟的自噬空泡，平均光密度顯著增加(P<0.05)；與千金藤素+?？颂婺峤M相比，3-MA組、PFT-α組綠色熒光的平均光密度明顯降低(P<0.05)；見(jiàn)(圖3、表4)。
圖3 各組細(xì)胞MDC染色結(jié)果(200×，400×)
表4 各組細(xì)胞自噬的自噬情況比較
五、各組細(xì)胞中自噬小體的形成情況
PC-9/IR組細(xì)胞顯示正常的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞器，沒(méi)有自噬小體；千金藤素組和?？颂婺峤M可見(jiàn)少量具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體形成；千金藤素+埃克替尼組細(xì)胞中可見(jiàn)較多的自噬小體，某些自噬小體的液泡內(nèi)還包含受損的細(xì)胞器，如線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；3-MA組和PFT-α組細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量較千金藤素+?？颂婺峤M明顯減少(見(jiàn)圖4)。
圖4 各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化(TEM，53000×)
六、各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與千金藤素組和?？颂婺峤M相比，千金藤素+?？颂婺峤M細(xì)胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)顯著增加，p-mTOR/mTOR的比值顯著降低(P<0.05)；與千金藤素+?？颂婺峤M相比，3-MA組、PFT-α組細(xì)胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)明顯降低，p-mTOR/mTOR的比值明顯升高(P<0.05)(見(jiàn)圖5，表5)。
圖5 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)
討 論
癌癥耐藥性是臨床治療中治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，克服癌細(xì)胞的耐藥性已成為癌癥治療領(lǐng)域要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)EGFR-TKI具有高度抵抗力的細(xì)胞中，自噬并沒(méi)有被上調(diào)，而這些細(xì)胞與雷帕霉素(一種自噬的誘導(dǎo)劑)共同處理可以部分恢復(fù)對(duì)EGFR-TKI的敏感性[11]。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能通過(guò)誘導(dǎo)自噬逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞的吉非替尼耐藥性；YM155(一種survivin小分子抑制劑)可通過(guò)誘導(dǎo)自噬顯著增強(qiáng)厄洛替尼對(duì)EGFR-TKI耐藥的NSCLC細(xì)胞系H1650和A549的敏感性[13]。表明自噬的誘導(dǎo)可能是恢復(fù)對(duì)EGFR-TKI耐藥細(xì)胞敏感性的有效策略。
千金藤素在臨床主要用于白細(xì)胞減少癥，近年的研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性有逆轉(zhuǎn)作用，如鼻咽癌多藥耐藥細(xì)胞CNE2/ADM、人類(lèi)髓性白血病多柔比星耐藥細(xì)胞K562/ADR；并且其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響與自噬密切相關(guān)[14]。項(xiàng)福英等[8]發(fā)現(xiàn)千金藤素可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路，增加SKOV3細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡數(shù)量，誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬；張巖昊等[15]發(fā)現(xiàn)千金藤素能誘導(dǎo)線(xiàn)粒體自噬的增加，增強(qiáng)多柔比星抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖的活性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究采用體外濃度梯度遞增的方法建立NSCLC細(xì)胞PC-9的?？颂婺崮退幖?xì)胞株P(guān)C-9/IR，從自噬的角度考察千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞耐藥性的作用；首先我們?cè)诩?xì)胞水平篩選千金藤素作用于PC-9/IR細(xì)胞的濃度，通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)千金藤素的濃度低于8 μmol/L時(shí)對(duì)PC-9/IR細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的抑制作用(抑制率<5%)，因此選擇此濃度作為后續(xù)耐藥性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中千金藤素的濃度。隨后我們將低毒劑量的千金藤素與不同濃度的?？颂婺峁餐饔糜赑C-9/IR細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞增殖情況來(lái)評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥后PC-9/IR細(xì)胞對(duì)?？颂婺崦舾行缘淖兓?，發(fā)現(xiàn)千金藤素與?？颂婺崧?lián)合用藥后，相比?？颂婺釂为?dú)用藥，PC-9/IR細(xì)胞的存活率顯著降低，PC-9/IR細(xì)胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆轉(zhuǎn)耐藥指數(shù)為10.11倍，說(shuō)明千金藤素能逆轉(zhuǎn)PC-9/IR細(xì)胞的埃克替尼耐藥性。為了進(jìn)一步探究千金藤素對(duì)PC-9/IR細(xì)胞的埃克替尼耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用是否與自噬相關(guān)，我們采用透射電子顯微鏡和MDC染色觀察細(xì)胞自噬情況，發(fā)現(xiàn)千金藤素與?？颂婺崧?lián)合應(yīng)用可顯著增加PC-9/IR細(xì)胞中自噬空泡和自噬小體的數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而經(jīng)過(guò)自噬抑制劑3-MA預(yù)處理的PC-9/IR細(xì)胞，自噬空泡和自噬小體的數(shù)量均減少，能降低千金藤素與?？颂婺崧?lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)PC-9/IR細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；提示千金藤素逆轉(zhuǎn)PC-9/IR細(xì)胞的?？颂婺崮退幮耘c促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。但其具體通過(guò)何種途徑發(fā)揮作用，尚不清楚。
近年來(lái)研究表明，抑癌基因p53作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期阻滯、凋亡中都發(fā)揮著重要作用；并且參與自噬活性的調(diào)節(jié)。約50%的晚期NSCLC病例中發(fā)生p53突變，導(dǎo)致腫瘤抑制功能喪失。重新激活突變型p53，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是p53靶向治療的目標(biāo)[16]。NSCLC組織中p53表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)[17]。Fan等[18]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過(guò)p53介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)NSCLC A549細(xì)胞凋亡和自噬；黃芩苷能通過(guò)激活p53途徑提高順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬以克服NSCLC的順鉑耐藥性[19]；重樓皂苷可上調(diào)p53，誘導(dǎo)caspase依賴(lài)性凋亡，并抑制mTOR信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制抗順鉑的人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)異喹啉生物堿(包括千金藤素)是一種新型的AMPK激活劑可誘導(dǎo)耐藥性癌癥中的自噬細(xì)胞死亡[21]；Unson等[22]發(fā)現(xiàn)千金藤素是用于治療具有p53突變的結(jié)直腸癌患者的有前途的藥物；而且能夠上調(diào)p53蛋白表達(dá)，抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，千金藤素與埃克替尼聯(lián)合作用于PC-9/IR細(xì)胞時(shí)，可上調(diào)p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)，并抑制p-mTOR的表達(dá)，使用3-MA預(yù)處理的PC-9/IR細(xì)胞中p53的表達(dá)降低，而且p53抑制劑Pifithrin-α可減少千金藤素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬；提示千金藤素可能通過(guò)上調(diào)p53的表達(dá)，誘導(dǎo)PC-9/IR細(xì)胞自噬，促進(jìn)其凋亡。
綜上所述，千金藤素可能通過(guò)激活p53介導(dǎo)的自噬，逆轉(zhuǎn)PC-9/IR細(xì)胞的?？颂婺崮退幮浴Ｓ捎趐53在自噬中的調(diào)控比較復(fù)雜，其對(duì)自噬的調(diào)控作用受細(xì)胞所處的環(huán)境和所受的壓力及其亞細(xì)胞定位的影響，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
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