陳建廣 王芳 王秀云

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率排在首位[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌常見的病理類型，約占肺癌的85%[2]。肺癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，雖然近年來肺癌的研究取得了重大進(jìn)展，但是患者5年生存率仍未見明顯提高[1]。深入分析肺癌的發(fā)病機(jī)制并探尋潛在的分子生物學(xué)指標(biāo)對其早期診斷和治療有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在表觀遺傳學(xué)和免疫調(diào)控等細(xì)胞生物學(xué)行為中起到重要作用，對腫瘤的早期診斷、療效和預(yù)后評價有一定價值[3-4]。前列腺雄激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本1(prostate androgen-regulated transcript 1，PART1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的lncRNA，在多種癌癥中高表達(dá)，可能發(fā)揮促癌基因作用[5-7]。PART1在肺癌中的作用機(jī)制既往報道較少，值得深入分析。

lncRNA與微小RNA(micro RNA)的相互調(diào)控關(guān)系在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色。miR-204-3p與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡密切相關(guān)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(insulinlike growth factor binding protein-2，IGFBP-2)是其作用靶點[6]。既往研究顯示，IGFBP-2可能是NSCLC的生物學(xué)標(biāo)志物[7]，因此可以推測miR-204-3p/IGFBP-2可能參與了NSCLC進(jìn)展。前期我們用Starbase軟件預(yù)測到miR-204-3p與PART1有結(jié)合位點，并且驗證了miR-204-3p與IGFBP-2也有結(jié)合位點，我們猜測，PART1可能通過miR-204-3p/IGFBP2軸參與肺癌的進(jìn)展。本研究通過體外細(xì)胞研究和動物研究對PART1在NSCLC中的作用進(jìn)行分析，并探討其作用機(jī)制。

資料與方法

一、實驗材料

NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299、H1650、H1975和PC9)和人正常支氣管上皮細(xì)胞系(HBE)均購于中科院上海細(xì)胞庫。10只4周齡雄性BALB/c裸鼠(18—20g)購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2017-0011]，使用許可證號[SYXK(魯)2017-0023])。胎牛血清、改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)培養(yǎng)基、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒購于北京邁瑞達(dá)科技有限公司。PCR引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司設(shè)計并提供，CCK-8試劑盒和Transwell小室購于蘇州宇恒生物科技有限公司，LipofectamineTM 2000購于美國Invitrogen 公司，shRNA-PART1、miR-204-3p inhibitor和攜帶有IGFBP-2全基因的過表達(dá)重組載體pcDNA-IGFBP-2以及對照空載體pcDNA均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。戊巴比妥購自上海信裕生物科技有限公司，18F-FDG購自北京善為正子醫(yī)藥技術(shù)有限公司。本實驗方案通過東營市人民醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)(IACUC:20170826007)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/mL及青霉素100 U/mL的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時進(jìn)行傳代。

三、RT-PCR檢測細(xì)胞中PART1相對表達(dá)量

用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后用PCR試劑盒，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃ 10min、95℃ 30s、60℃ 15s、72℃ 20s，共計40個循環(huán)。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。內(nèi)參為GAPDH，用2-△△Ct法計算PART1基因相對表達(dá)量。

四、抑制PART1對NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

1 轉(zhuǎn)染 用LipofectaminETM 2000試劑轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞：首先制備LipofectamineTM 2000復(fù)合物和DNA復(fù)合物(每孔含4μg濃度為1 μg/μL的質(zhì)粒和246 μL的無血清培養(yǎng)基)，混勻后靜置20 min。將混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)48h。將細(xì)胞分為sh-NC組和sh-PART1組，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

2 CCK8法和克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖 CCK-8法：用CCK-8試劑盒檢測A549細(xì)胞活性，細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h時加入CCK-8試劑。用酶標(biāo)儀處讀取490nm處吸光度值?？寺⌒纬蓪嶒灒河靡鹊鞍酌赶D(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞，培養(yǎng)3周。當(dāng)出現(xiàn)癌細(xì)胞克隆時停止培養(yǎng)。用4 %多聚甲醛進(jìn)行固定，30 min后用結(jié)晶紫染色，計算克隆細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞樣本設(shè)置4個復(fù)孔，實驗重復(fù)4次。

3 Transwell檢測細(xì)胞侵襲 在Transwell遷移板上室鋪基質(zhì)膠，隨后將A549細(xì)胞接種于Transwell小室；下室中加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后取出Transwell小室，用多聚甲醛固定黏附于下室微孔膜下面的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色15min，干燥后在顯微鏡(放大200倍)下取5個視野進(jìn)行觀察，計算平均侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞樣本設(shè)置4個復(fù)孔，實驗重復(fù)4次。

4 體外損傷愈合實驗檢測細(xì)胞遷移 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時用無菌槍頭進(jìn)行劃痕。培養(yǎng)0h、24h時用顯微鏡拍照，損傷愈合率(%)=(0h劃痕寬度-24h劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%。

5 抑制PART1對裸鼠腫瘤增殖的影響 10只BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于本院動物中心，隨機(jī)分為sh-NC組和sh-PART1組，每組5只，自由進(jìn)食和水。取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×107個/mL。無菌條件下，將BALB/c裸鼠固定，將0.2 mL含有瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行右側(cè)前肢腋下接種，建立腫瘤模型[8]。注射后第6天起，每3天測量1次腫瘤體積，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，腫瘤體積=1/2ab2[9]。

6 PART1、miR-204-3p和IGFBP2靶向作用關(guān)系的驗證 用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)行靶向關(guān)系驗證。(1)將PART1候選靶基因miR-204-3p 3’UTR靶序列插入螢火蟲熒光素酶基因下游。將重組表達(dá)載體pcDNA-EGFP-pre-PART1和miR-204-3p驗證載體pmir-GLO-PART1-miR-204-3p 3’UTR共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，設(shè)置空質(zhì)粒載體、PART1過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染對照組。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后48h用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲和海腎(內(nèi)參)熒光值。(2)將miR-204-3p的候選靶基因IGFBP2 3’UTR靶序列插入螢火蟲熒光素酶基因下游。隨后重組表達(dá)載體pcDNA-EGFP-pre-miR-204-3p與IGFBP2驗證載體pmir-GLO-miR-204-3p-IGFBP2 3’UTR分別共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞，另外設(shè)置空質(zhì)粒載體、miR-204-3p過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染對照組。轉(zhuǎn)染48h后檢測螢火蟲和海腎(內(nèi)參)熒光值。

7.PART1通過miR-204-3p/IGFBP2軸對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 將A549細(xì)胞分為NC組(轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒)、PART1 shRNA組(僅轉(zhuǎn)染shRNA-PART1)、PART1 shRNA+miR-204-3p inhibitor組(同時轉(zhuǎn)染shRNA-PART1和miR-204-3p inhibitor)、shRNA-PART1+IGFBP2組(同時轉(zhuǎn)染PART1 shRNA和過表達(dá)重組載體pcDNA-IGFBP2)，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染48 h后檢測IGFBP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，實驗重復(fù)4次。蛋白表達(dá)水平檢測用Western-blot法，大致步驟：用RAPI裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白，用半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2h，加入抗IGFBP2(1∶1000)4℃過夜孵育，次日除去一抗，用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗(羊抗兔，1∶500)，封閉1h。以GAPDH作為內(nèi)參，用ECL發(fā)光儀對蛋白成像，用Image J軟件分析灰度值。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、PART1在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)

與HBE細(xì)胞比較，A549、H1299、H1650、H1975和PC9細(xì)胞中PART1相對表達(dá)量明顯較高(P<0.05)(見圖1)。

圖1 PART1在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平

以GAPDH為內(nèi)參基因，與HBE細(xì)胞比較，*P<0.05

二、敲降PART1表達(dá)對A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

用克隆形成實驗和CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖，Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲力，體外損傷愈合實驗檢測細(xì)胞遷移力。sh-PART1組PART1相對表達(dá)量、細(xì)胞增殖力、侵襲力和遷移力明顯低于sh-NC組(P<0.05)(見圖2)。

圖2 敲降PART1表達(dá)對A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

三、抑制PART1對裸鼠腫瘤增殖的影響

右側(cè)前肢腋下接種A549細(xì)胞，制備腫瘤模型。在動物實驗中，重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，sh-NC組腫瘤體積隨時間的增加程度高于sh-PART1組(P<0.05)。第21d時，sh-NC組腫瘤重量大于sh-PART1組(P<0.05)(見圖3)。sh-PART1對腫瘤的抑制率為59.87%。

圖3 抑制PART1對裸鼠腫瘤增殖的影響

四、PART1靶向調(diào)控miR-204-3p介導(dǎo)IGFBP2在癌細(xì)胞中的表達(dá)

用Starbase軟件預(yù)測到miR-204-3p與IGFBP2有結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，過表達(dá)miR-204-3p使熒光素酶活性下降(P<0.05)。PART1敲低可以促進(jìn)miR-204-3p的表達(dá)(P<0.05)。IGFBP2基因與miR-204-3p也有結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，過表達(dá)miR-204-3p使熒光素酶活性下降(P<0.05)。抑制miR-204-3p可促進(jìn)IGFBP2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)(見圖4)。

圖4 PART1與miR-204-3p/IGFBP2軸的調(diào)控關(guān)系驗證

五、敲降PART1通過上調(diào)miR-204-3p/IGFBP2軸對癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

與NC組相比，敲降PART1表達(dá)可以明顯抑制細(xì)胞中IGFBP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)(見圖5)。同時，轉(zhuǎn)染PART1 shRNA+miR-204-3p-inhibitor或者PART1-shRNA+ IGFBP2過表達(dá)載體后，IGFBP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較PART1 shRNA組明顯上調(diào)(P<0.05)。敲降PART1可顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移(P<0.05)。同時敲降miR-204-3p或過表達(dá)IGFBP2則下調(diào)了敲降PART1對細(xì)胞的抑制作用(P<0.05)(見圖5，6)。以上說明，敲降PART1可通過上調(diào)miR-204-3p/IGFBP2軸抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

圖5 PART1和miR-204-3p對IGFBP2基因和蛋白表達(dá)的影響

圖6 敲降PART1通過上調(diào)miR-204-3p/IGFBP2軸對癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

討 論

NSCLC嚴(yán)重威脅了人類生命健康，深入探討其發(fā)病機(jī)制具有重要意義。lncRNA可以靶向作用于miRNA，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。PART1定位于5q12上，最早被發(fā)現(xiàn)在前列腺中表達(dá)，可以調(diào)節(jié)雌激素受體基因的表達(dá)，參與前列腺癌的發(fā)生[11]。后來，越多越多研究證實，PART1與乳腺癌[12]、宮頸癌[13]、膠質(zhì)瘤[6]和肝細(xì)胞癌[14]等多種腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。PART1在NSCLC中的作用及其機(jī)制，既往報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，與HBE細(xì)胞比較，A549、H1299、H1650、H1975和PC9細(xì)胞中PART1相對表達(dá)量明顯較高。Zhu等[15]也發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞A549、H1650、SK-MES-1和H1975中PART1相對表達(dá)量高于HBE細(xì)胞。以上提示，PART1可能參與了NSCLC的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，下調(diào)PART1基因表達(dá)可以明顯抑制A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。在動物研究中，抑制PART1的表達(dá)可以明顯降低腫瘤的體積和重量。說明PART1可能參與NSCLC的進(jìn)展。PART1參與腫瘤進(jìn)展的機(jī)制比較復(fù)雜，Sun等[16]發(fā)現(xiàn)PART1可以調(diào)控Toll樣受體通路影響前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。PART1主要通過調(diào)控miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)參與腫瘤進(jìn)展。PART1可以通過miR-150-5p/miR-520h/CTNNB1通路和Wnt/β-catin通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[17]；能通過miR-4516信號通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[12]。

本課題組用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測到miR-204-3p與PART1有結(jié)合位點，miR-204-3p和IGFBP2有結(jié)合位點，隨后雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果予以證實。miR-204-3p在腫瘤中可能發(fā)揮抑癌作用[18-19]。miR-204-3p與IGFBP2的調(diào)控關(guān)系既往已被證實，Chen等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-204-3p可以靶向作用于IGFBP2，參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。IGFBP2參與了NSCLC的進(jìn)展，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵犯、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和耐藥等密切相關(guān)[21-22]。本研究轉(zhuǎn)染PART1 shRNA+miR-204-3p-inhibitor或者PART1-shRNA+ IGFBP2過表達(dá)載體后，IGFBP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較PART1 shRNA組明顯上調(diào)。敲降PART1可顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。同時敲降miR-204-3p或過表達(dá)IGFBP2則下調(diào)了敲降PART1對細(xì)胞的抑制作用，說明敲降PART1可通過上調(diào)miR-204-3p/IGFBP2軸抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

綜上，PART1在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，可通過調(diào)控miR-204-3p/IGFBP2軸促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。PART1有望為診治NSCLC提供一個潛在靶點，未來需要分析PART1與NSCLC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并探尋PART1早期診斷NSCLC的價值。