謝雙燕，崔燕海，陳蕓芝，陳雪芹，5，李博厚，劉雙信，5，何朝生

［1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510515；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）腎內(nèi)科，廣州 510080；3.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）影像科，廣州 510080；4.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080；5.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 511436］

心血管疾病是維持性血液透析（maintenance hemodialysis，MHD）患者死亡的首要原因，MHD 患者心血管鈣化發(fā)生率高達80%～90%［1］。作為腫瘤壞死超家族成員，核因子NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）和骨保護素（osteoprotegerin，OPG）在骨形成的調(diào)節(jié)作用已被證實［2］。早期研究已發(fā)現(xiàn)，RANKL/OPG系統(tǒng)與血管鈣化的發(fā)生密切相關(guān)［3］。成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）主要在肝臟合成，在慢性腎臟?。?］和冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊咧校?］也表達增加，且體外試驗證實FGF21 可通過RANKL/OPG 系統(tǒng)達到抑制血管鈣化的作用［6］。但目前關(guān)于MHD 患者RANKL/OPG 系統(tǒng)及FGF21 與冠狀動脈鈣化的關(guān)系的研究尚少，且血清RANKL 濃度與血管鈣化的關(guān)系尚有爭議。本研究通過分析探討MHD患者血清RANKL、OPG、FGF21 濃度與冠狀動脈鈣化的關(guān)系，為MHD 患者血管鈣化進展提供關(guān)注及隨訪指標。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2020 年12 月期間在廣東省人民醫(yī)院行血液透析時間＞6 個月，并剔除冠狀動脈支架植入術(shù)、心腦血管事件急性期及惡性腫瘤患者后，參與本研究共178 例MHD 患者及同期健康人群21 例，所有患者及健康人群均知情同意。178 例MHD 患者年齡為（57.9±1.1）歲，中位透析齡為60（25～75）個月。所有研究對象中，原發(fā)病為慢性腎炎65 例（36.5%），糖尿病腎病46 例（25.8%），高血壓腎病18 例（10.1%），IgA 腎病14 例（7.8%），多囊腎7 例（4%），梗阻腎6 例（3.3%），間質(zhì)性腎炎3 例，狼瘡腎炎2 例，抗中性粒細胞胞漿抗體相關(guān)血管炎腎損害2 例，F(xiàn)abry 病1 例，病因不明14 例。

1.2 臨床資料收集

收集患者年齡、性別、血壓、透析齡以及血鈣、血磷、甲狀旁腺激素（PTH）、堿性磷酸酶（ALP）等資料。

1.3 血清RANKL、OPG、FGF21 濃度測定

所有MHD 患者均在2020-12-1 至2020-12-31期間透析前采集靜脈血，健康人群晨起空腹采血，離心分離上清，-80 ℃保存，酶聯(lián)免疫吸附試驗法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清RANKL、OPG 及FGF21 濃度；RANKL、OPG 靈敏度1.95 pg/mL，F(xiàn)GF21 靈敏度3.9 pg/mL，試劑盒均購置CUSABIO 公司，按照說明書操作，批內(nèi)變異系數(shù)均小于8%，批間系數(shù)均小于10%。

1.4 冠狀動脈鈣化評分測定及分組

在采血期間的1 年內(nèi)（202-01-01 至2020-12-31）使用多層螺旋計算機斷層掃描（multislice spi?ral computed tomography，MSCT）平掃受試者胸部，由專職的放射科醫(yī)生根據(jù)鈣化血管進行測量，并通過鈣化積分軟件得到冠狀動脈鈣化積分（coronary artery calcification score，CACs）（Agaston評分）［7］。Philip 等［8］發(fā)現(xiàn)CACs＞400 分時，心血管事件尤其是冠狀動脈事件的發(fā)生率顯著升高。本研究根據(jù)Rumberger 冠狀動脈鈣化分級法將178 例患者分為3組：無鈣化組（CACs＜10分）37例、輕度鈣化組（10 分＜CACs＜400 分）44 例、重度鈣化組（CACs＞400 分）97 例。冠狀動脈鈣化定義為CACs＞10 分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以（）表示，組間差異采用方差分析；非正態(tài)分布計量資料用［M（Q1～Q3）］表示，組間差異采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以［n（%）］表示，采用卡方（χ2）檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson 或Spearman 秩檢驗，計算RANKL、OPG 及FGF21 與CACs 的相關(guān)系數(shù)。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析診斷界點。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冠狀動脈鈣化情況

冠狀動脈鈣化的發(fā)生率為79.2%（141/178）。3 組患者性別構(gòu)成、血清鈣和磷、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶和血脂濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與無鈣化組患者比較，重度鈣化組患者的年齡、透析齡、血肌酐、糖化血紅蛋白和OPG 濃度均顯著升高，舒張壓則降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 3 組患者臨床基本資料比較［，M（Q1～Q3），n（%）］

表1 3 組患者臨床基本資料比較［，M（Q1～Q3），n（%）］

注：與無鈣化組，*P＜0.05；與輕度鈣化組比較，1）*P＜0.05，1 mmHg=0.133 kPa

2.2 血清RANKL、OPG 濃度與其他臨床指標的相關(guān)分析結(jié)果

雙變量相關(guān)性（Spearman）分析顯示，血清RANKL濃度與甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶成正相關(guān)，與血肌酐成負相關(guān)；血清OPG 濃度與MHD 患者年齡、透析齡、堿性磷酸酶及糖化血紅蛋白成正相關(guān)，與血肌酐成負相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 血清RANKL、OPG 與其他臨床指標相關(guān)性分析

2.3 血清RANKL、OPG 濃度與冠狀動脈鈣化積分的相關(guān)分析結(jié)果

Spearman 分析顯示血清RANKL 濃度與CACs無關(guān)（圖1A），且不同鈣化分組的RANKL 濃度比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2A）；Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)OPG 濃度與CACs 正相關(guān)（r=0.217，圖1B）；重度鈣化組的OPG 濃度較輕度鈣化組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2B）。

圖1 RANKl、OPG 與CACs 的相關(guān)散點圖（A：血清RANKl 濃度與CACs 的相關(guān)散點圖；B：血清OPG 濃度與CACs 的相關(guān)散點圖）

圖2 無鈣化組、輕度鈣化組、重度鈣化組患者血清RANKL、OPG 濃度比較的柱狀圖（A：無鈣化組、輕度鈣化組與重度鈣化組患者的RANKL 濃度比較柱狀圖；B：無鈣化組、輕度鈣化組與重度鈣化組患者血清OPG 濃度比較柱狀圖）

2.4 健康對照組及不同鈣化組研究對象的血清FGF21 濃度比較

不同鈣化分組患者的血清FGF21 濃度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但均高于對照組，且是健康人群的11 倍左右（P＜0.001）（圖3）。

圖3 健康對照組及不同鈣化組間血清FGF21 濃度比較柱狀圖

2.5 冠狀動脈鈣化積分與其他指標的相關(guān)性分析結(jié)果

雙變量相關(guān)性分析表明CACs 與MHD 患者年齡、透析齡、糖化血紅蛋白正相關(guān)，與舒張壓及血清肌酐濃度負相關(guān)（P＜0.05）（表3）。根據(jù)CACs=400 分為臨界點將178 例MHD 患者分為輕度鈣化組、重度鈣化組，二分類Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)年齡、透析齡和糖化血紅蛋白是冠狀動脈鈣化進展的獨立危險因素（圖4）。

圖4 冠狀動脈鈣化危險因素森林圖

表3 CACs 與其他指標的相關(guān)性分析結(jié)果

2.6 不同指標對重度冠狀動脈鈣化診斷的受試者工作特征曲線分析結(jié)果

OPG 對重度冠狀動脈鈣化診斷的ROC 曲線下面積（the area under the curve，AUC）為0.66，其特異度和靈敏度同時達到最高的診斷界點為773.7 pg/mL，此時對重度冠狀動脈鈣化診斷的敏感度為60.1%，特異度為67.6%；年齡、透析齡和糖化血紅蛋白作為冠狀動脈鈣化進展的獨立危險因素，其ROC 的AUC 分別為0.63、0.66、0.67，與OPG 對MHD 重度鈣化患者診斷價值相似，而聯(lián)合OPG、年齡、透析齡及糖化血紅蛋白對重度冠狀動脈鈣化的診斷的AUC 可達0.77，較單獨指標而言具有更高的診斷價值（結(jié)果見表4，圖5）。

圖5 不同指標對重度冠狀動脈鈣化診斷的ROC 圖

表4 不同指標對重度冠狀動脈鈣化診斷的ROC分析結(jié)果

3 討論

近年來MHD 患者年病死率仍居高不下，達15%～20%［9］，而心血管疾病是MHD 患者死亡的主要原因，Yeboah 等［10］發(fā)現(xiàn)冠狀動脈鈣化對心血管疾病發(fā)生有很強的預(yù)測價值，因此對MHD 患者冠狀動脈鈣化的發(fā)生、發(fā)展進行及早的干預(yù)，對減少MHD 患者心血管疾病事件的發(fā)生及病死率，提高MHD 生存時間及質(zhì)量有重大意義。

CACs 是以MSCT 為基礎(chǔ)進行檢測和定量的，MSCT 作為診斷血管鈣化的“金標準”［11］，與數(shù)字減影血管造影（DSA）在冠狀動脈疾病的診斷價值相當［12］。本研究進行冠狀動脈鈣化定量發(fā)現(xiàn)，MHD 患者重度冠狀動脈鈣化發(fā)生率甚至超過50%（54.5%），預(yù)示著MHD 患者出現(xiàn)冠狀動脈疾病的高風(fēng)險［8］。

Panizo 等［3］發(fā)現(xiàn)RANKL 在血管鈣化病變組織中表達增加，直接證明了血管的RANKL 表達增加與血管平滑細胞（VSMC）鈣化相關(guān)，但同時發(fā)現(xiàn)血清RANKL 濃度并未改變。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，血清中RANKL 濃度與CACs 無關(guān)，且與傳統(tǒng)的血管危險因素年齡、血脂等無關(guān)，與其他作者研究結(jié)果相似［13］。OPG 主要在成骨細胞表達，拮抗RANKL 作用。早在1998 年的動物試驗中就已發(fā)現(xiàn)OPG 基因敲除的小鼠具有嚴重的骨質(zhì)疏松及動脈鈣化，提示OPG/RANKL 系統(tǒng)與血管鈣化密切相關(guān)［14］。研究發(fā)現(xiàn)，OPG 不僅是骨重建的關(guān)建因素，同時也是MHD 患者發(fā)生CAC 的強預(yù)測因子［15］，與這些研究類似，本研究結(jié)果顯示，血清OPG 濃度與CACs 正相關(guān)，且與冠狀動脈鈣化嚴重程度有關(guān)。有趣的是，Marion 等［16］研究發(fā)現(xiàn)OPG 濃度在757.7 pg/mL 以上時可預(yù)測慢性腎臟?。–KD）患者冠狀動脈鈣化的發(fā)生，而本研究同時發(fā)現(xiàn)OPG 濃度在773.7 pg/mL 以上時其診斷敏感度和特異度最高。動物模型研究表明OPG 可抑制血管鈣化，其OPG 抑制血管鈣化的機制：（1）OPG 抑制骨吸收的同時抑制血管鈣化；（2）RANKL 與RANK 結(jié)合增加血管平滑細胞鈣化，OPG 通過直接抑制RANKL 起到抑制血管鈣化作用［3］。因此，對患者血清OPG濃度的隨訪，可提高對冠狀動脈鈣化進展的認識，減少MHD 患者心血管事件的發(fā)生。

FGF21 作為糖脂代謝的重要調(diào)節(jié)因子，首先在肝臟組織中被發(fā)現(xiàn)，也表達于胰腺、骨骼肌和腎臟組織［17］。在動物模型中已發(fā)現(xiàn)FGF21 可通過RANKL/OPG 系統(tǒng)、BMP2/Smad 信號通路抑制血管鈣化［6］，臨床研究也顯示冠心病和慢性腎臟病患者血清FGF21 濃度明顯升高［4，5］。LEE 等［18］則認為，血清FGF21 濃度與冠狀動脈狹窄狀態(tài)無關(guān)，而是與血脂代謝及胰島素抵抗相關(guān)，本研究結(jié)果同樣顯示MHD 患者FGF21 與CACs 及冠狀動脈鈣化嚴重程度無關(guān)。在本研究中，血清FGF21 濃度較健康人群明顯升高，大約11 倍，考慮到本研究對象為MHD 患者，F(xiàn)GF21 濃度的升高可能是由于其高血壓、血脂異常及糖尿病等傳統(tǒng)冠狀動脈鈣化危險因素影響更顯著。值得注意的是，最近的研究發(fā)現(xiàn)：血清FGF21 濃度可作為預(yù)測MHD 患者主動脈鈣化的指標，同時通過體外實驗發(fā)現(xiàn)FGF21 可增強甲狀旁腺激素對主動脈內(nèi)皮細胞的鈣化作用［19］。

本研究也存在局限性，首先本研究為回顧性研究，所有MHD 患者在研究前都已進行了計算機斷層掃描檢測，可導(dǎo)致一部分患者因不具備計算機斷層掃描檢測結(jié)果而被排除，造成選擇偏差；其次是血清FGF21 在透析患者的冠狀動脈鈣化及主動脈鈣化關(guān)系的不同需要進一步研究。

總之，通過對最近提出的預(yù)測血管鈣化的臨床指標：RANKl、OPG 及FGF21 的研究，證實了血清OPG 濃度與MHD 患者冠狀動脈鈣化嚴重程度相關(guān)，血清OPG 濃度可作為預(yù)測冠狀動脈鈣化進展的臨床指標之一；循環(huán)中的RANKL 濃度在冠狀動脈鈣化中未見改變；血清FGF21 濃度與MHD患者冠狀動脈鈣化及進展無關(guān)，但較健康人群明顯升高，其機制尚未完全明確，需要進一步探討及分析。