王瀟雄，江驍，申太鵬，姚玉唐，陸?zhàn)?，陳世容，張歌，李秀麗，諶佳琪，寇瑩，肖定瓊，趙檬，周星，楊童舒，程祝忠

610041 成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學醫(yī)學院 放射腫瘤學四川省重點實驗室(王瀟雄、江驍、申太鵬、姚玉唐、陸?zhàn)?、陳世容、張歌、李秀麗、諶佳琪、寇瑩、肖定瓊、趙檬、楊童舒、程祝忠)；637000 四川 南充，川北醫(yī)學院 影像學院(周星)

乏氧是實體腫瘤組織中常見的現(xiàn)象。腫瘤具有無限增殖的特點，當其增殖速度超過其血管生長的速度，導致內部血流減少，供氧能力減弱，局部組織的氧分壓降低，便形成了乏氧區(qū)域[1]。腫瘤細胞會通過改變自身內源性基因的表達來適應乏氧微環(huán)境，乏氧能夠誘導乏氧誘導因子-1α、血管內皮生長因子、生長因子及相關細胞分裂周期蛋白的表達，從而降低射線和某些化療藥物對腫瘤細胞的殺傷力，導致實體腫瘤的放療抵抗及化療耐藥[2-7]。較多臨床研究表明，腫瘤的乏氧程度與其預后呈負相關[8-10]，腫瘤組織內部存在的乏氧細胞成為腫瘤易復發(fā)、難治愈的重要原因[11-12]。探測腫瘤的乏氧部位及乏氧程度對于制訂最有效的放療、化療方案顯得尤為重要。

目前存在著多種直接或者間接測定組織氧水平的方法，例如氧電極測定、組織形態(tài)分析、乏氧標志物檢測、彗星電泳等。但這些技術具有或大或小的創(chuàng)傷性，或者不能準確實時地反應腫瘤組織乏氧情況，在臨床應用中存在一定的局限性[13-15]。近年來，隨著正電子及單光子放射性藥物的開發(fā)，人們在腫瘤等疾病診斷方面取得了一些新的進展。在乏氧顯像方面，利用18F、99mTc、64Cu等核素標記的乏氧顯像劑如18F-氟赤硝基咪唑(18F-fluoroerythronitroimidazole,18F-FETNIM)、18F-fluoromisonidazole(18F-FMISO)、99mTc-4,9-diaza-3,3,10,10-tetramethyldodecan-2,11-dione dioxime(99mTc-HL91)、64Cu-diacetyl-bis(N4-methylthiosemicarbazone)(64Cu-ATSM)進行正電子發(fā)射型計算機斷層掃描顯像(positron emission tomography,PET)或單光子發(fā)射型計算機斷層掃描顯像可對活體內的乏氧組織定性和定量檢測[16-19]，具有無創(chuàng)、可動態(tài)、可重復等優(yōu)勢，是目前乏氧檢測研究的熱點。18F-FETNIM是一種具有較大潛力的乏氧顯像劑，其周圍組織代謝率、乏氧組織代謝率、脫氟率、脂/水溶性均適合于PET乏氧顯像[16,20]。18F標記正電子藥物半衰期為109.8 min，需醫(yī)療機構現(xiàn)制現(xiàn)用，其合成產(chǎn)率及合成時間很大程度影響其臨床研究及應用，但目前國內鮮有醫(yī)療機構報道其詳細制備工藝及質控方法。因此，本研究將詳細報道其優(yōu)化后的制備、分離純化及質控方法，該內容將有助于18F-FETNIM臨床推廣應用，同時也為其他18F標記正電子藥物的制備提供一些啟示和參考。

1 材料和方法

1.1 設備和材料

CFN-MPS-200合成系統(tǒng)及HM-10回旋加速器(日本住友株式會)；YMC-PACK-ODS-AM C18柱(10 mm × 250 mm，日本YMC公司)；Jasco PU-2086 Plus半制備型高效液相色譜系統(tǒng)(high performance liquid chromatography,HPLC,日本Jasco公司)；WondaSil C18柱(4.6 mm × 250 mm)及LC-15C分析型HPLC(日本島津公司)；MINI-scan薄層色譜掃描儀(美國Bioscan公司)；CRC-25R型活度計(美國Capintec公司)。

1-(2′-硝基-1′-咪唑基)-2，3-O-異亞丙基-4-甲苯磺?；⊥?德國ABX公司)；穴醚222(K222)、碳酸鉀、乙腈、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、抗壞血酸(美國Sigma公司)；注射用水及生理鹽水(四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司)；QMA陰離子交換柱(美國Waters公司)；薄層硅膠板(德國Macherey Nagel公司)；Millex-GS無菌過濾器(0.22 μm，美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.118F-FETNIM的合成路線 如圖1所示，前體1-(2′-硝基-1′-咪唑基)-2，3-O-異亞丙基-4-甲苯磺酰基丁烷與18F離子發(fā)生親核取代反應，生成的中間體經(jīng)鹽酸水解后得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品溶液再經(jīng)氫氧化鈉中和、半制備型HPLC分離純化、旋蒸系統(tǒng)除溶劑后最終得到產(chǎn)品。

1.2.218F-FETNIM的合成過程 合成裝置如圖2所示，用10 MeV、60 μA的質子束流連續(xù)轟擊填充有18O-H2O的液體靶 40 min，通過18O(p，n)18F核反應得到18F離子。用氮氣正壓將帶有18F離子的靶水收集到靶水收集瓶中。接著用氮氣正壓使靶水收集瓶中的靶水通過QMA陰離子交換柱，使18F離子吸附于QMA陰離子交換柱上。用K2CO3/K222的混合溶液將QMA陰離子交換柱上的18F離子淋洗入反應瓶中。將反應瓶溫度升高至110 ℃，待將淋洗液完全蒸干后冷卻至室溫，再加入0.3 mL無水乙腈，110 ℃加熱至乙腈完全蒸干。加入1 mL含有2 mg 1-(2′-硝基-1′-咪唑基)-2，3-O-異亞丙基-4-甲苯磺?；⊥榈臒o水乙腈溶液至反應瓶，在密閉的反應瓶中105 ℃氟化5 min，然后將液體蒸干。加入0.9 mL濃度為2 M的HCl，在密閉反應瓶中升溫至105 ℃水解5 min。加入0.8 mL 濃度為2 M的NaOH進行中和后，再將反應瓶中粗產(chǎn)品轉移至半制備HPLC系統(tǒng)的進樣器中。

圖1 18F-FETNIM的合成路線

圖2 制備18F-FETNIM的合成裝置

1.2.318F-FETNIM的分離純化 將進樣器中粗產(chǎn)品注入帶放射性檢測器的半制備型HPLC系統(tǒng)中。分離純化條件如下：流動相為V(水)∶V(乙腈)∶V(乙醇)=500∶90∶10，流速為4.0 mL/min，紫外波長為325 nm，色譜柱為YMC-PACK-ODS-AM C18柱(10 mm × 250 mm)。收集保留時間在5～7 min內的放射組分(圖3)于旋蒸瓶中160 ℃蒸干(旋蒸瓶中提前加入0.1 mL 100 mg/mL的抗壞血酸)，用8 mL生理鹽水溶解產(chǎn)品并通過0.22 μm Millex GS無菌濾膜，得到最終的18F-FETNIM產(chǎn)品。

圖3 粗產(chǎn)品的分離純化圖譜

1.2.4 產(chǎn)品的質量分析 觀察產(chǎn)品溶液的顏色及澄明度，活度計測量產(chǎn)品溶液的活度并計算放射性濃度，用精密pH試紙測定產(chǎn)品溶液的pH值。將產(chǎn)品及標準品19F-FETNIM注入帶放射性檢測器的分析型HPLC(WondaSil C18柱，4.6 mm× 250 mm)中分析保留時間、放射化學純度，條件如下：流動相為V(水)∶V(乙腈)=95∶5，流速1 mL/min，紫外波長254 nm，柱溫40℃。另外利用帶放射性檢測器的薄層色譜(thin layer chromatography,TLC)分析產(chǎn)品的放射化學純度及產(chǎn)品在4 h內的穩(wěn)定性，展開劑為V(氯仿)∶V(甲醇)=70∶30，固定相為薄層硅膠板。

2 結 果

2.1 專利申請

采用此方法合成18F-FETNIM的合成裝置及系統(tǒng)已獲得實用新型專利授權，專利名稱為：一種用于合成18F-氟赤硝基咪唑的系統(tǒng)、一種用于合成18F-氟赤硝基咪唑的卡套，專利號為：ZL201821957828.6.、ZL201821942477.1.。

2.2 18F-FETNIM的合成及質量分析

采用此方法的合成時間約為50 min，合成產(chǎn)率為24%～30%(衰減校正后，n=8)，18F-FETNIM放射性濃度>1.11×109GBq/mL，產(chǎn)品為無色透明溶液，pH值在7.0～7.5之間，分析型HPLC顯示產(chǎn)品的放射化學純度高于97%(圖4A)，產(chǎn)品與19F-FETNIM標準品保留時間一致(圖4A、B)，產(chǎn)品中除含有少量的抗壞血酸及其可能的氧化產(chǎn)物外，無其他化學雜質(圖4C、D)。TLC顯示產(chǎn)品在上述條件下的比移值(Rf值)約為0.8，放射化學純度大于99%且在4 h內穩(wěn)定(圖5)。以上各項質控內容已覆蓋正電子放射性藥品質量控制中的快速質量控制原則[21]。

圖4 產(chǎn)品的HPLC分析圖譜

圖5 產(chǎn)品的TLC圖譜

3 討 論

硝基咪唑類乏氧顯像劑在乏氧顯像劑大家族中具有重要地位，其可以通過彌散作用進入到細胞內并在胞內黃嘌呤氧化酶作用下發(fā)生硝基的單電子還原，進而產(chǎn)生自由基陰離子。在正常情況下，自由基陰離子能夠迅速被再氧化成原化合物擴散到細胞外；而在乏氧狀況下，自由基陰離子將被進一步還原并與細胞內其他組分結合，從而滯留于細胞內[22-24]。臨床上使用及研究較多的硝基咪唑類乏氧顯像劑主要包括18F-FMISO及18F-FETNIM。相較于18F-FETNIM來說，18F-FMISO具有過高的脂溶性，其在正常組織中具有更多的攝取且洗脫較慢，注射后需要較長時間才能達到理想的本底。Yang等[16]的研究表明，18F-FETNIM比18F-FMISO具有更高的親水性，在乳腺癌小鼠移植瘤模型中，18F-FETNIM注射4 h后的腫瘤/血液比(T/B)明顯高于18F-FMISO。趙偉等[25]發(fā)現(xiàn)在SPCA-1人肺腺癌裸鼠移植瘤模型中，18F-FETNIM在腎中代謝最高，而在脂肪和骨骼中代謝較低，腫瘤/非腫瘤(T/NT)比值較高且隨時間增加，腫瘤/血液攝取比(T/B)為1.69±0.37，腫瘤/肌肉攝取比(T/M)為1.57±0.47。Lehti?等[26]利用18F-FETNIM檢測頭頸腫瘤患者的乏氧情況，3小時的腫瘤/肌肉比(T/M)在1～4，優(yōu)于18F-FMISO。國內外有較多研究討論了18F-FETNIM進行乏氧顯像的價值，發(fā)現(xiàn)18F-FETNIM的周圍組織代謝率、乏氧組織代謝率、脫氟率、脂/水溶性均適合于PET乏氧顯像[27-29]，表明18F-FETNIM是一種具有較大潛力的乏氧顯像劑。

自Yang及Grierson分別報道了18F-FMISO及18F-FETNIM的合成路線[16,30]，國內外有關乏氧顯像劑的研究主要集中于硝基咪唑類乏氧衍生物前體的開發(fā)，而對相關制備工藝的研究較少。本研究在Yang等[16]所報道合成路線的基礎上，利用優(yōu)化后制備工藝及CFN-MPS-200合成系統(tǒng)，實現(xiàn)了18F-FETNIM的快速穩(wěn)定合成。眾所周知，在18F親核取代反應過程中，即使微量水的引入也會導致氟化失敗，且該因素是導致此類正電子藥物合成失敗的重要原因。在對前體進行18F氟化前，可以選擇向反應瓶中直接加入前體，或加入一次或者多次無水乙腈除水。本課題組嘗試過向反應瓶中直接加入前體，合成失敗率超過30%，大概率是因為反應瓶及合成管線殘留有微量水的原因，而加入一次無水乙腈除水后則未出現(xiàn)合成失敗的情況。因此，本研究選擇在氟化前向反應瓶中加入一次無水乙腈除水，保證了合成的穩(wěn)定性。同時本研究也對氟化時間及溫度進行了對比分析，發(fā)現(xiàn)在105 ℃氟化5 min能夠達到24%～30%的合成產(chǎn)率，在此條件上，降低氟化溫度或時間則明顯降低合成產(chǎn)率，而增加氟化溫度或時間則合成產(chǎn)率無明顯改變。因此，本研究在18F氟化這一步選擇105 ℃氟化5 min，保證其在較短的時間內能夠得到較高的合成產(chǎn)率。Yang等[16]所報道的合成產(chǎn)率在20%～30%，但其合成時間大約為70 min；Gr?nroos等[20]所報道的合成時間約為50 min，但其合成產(chǎn)率為13%～20%。本研究基于優(yōu)化后的制備工藝及CFN-MPS-200合成系統(tǒng)，合成時間約為50 min，產(chǎn)率在24%～30%之間，其合成時間更短，合成產(chǎn)率更高。18F標記正電子藥物半衰期為109.8 min，需醫(yī)療機構現(xiàn)制現(xiàn)用，縮短合成時間及提高合成產(chǎn)率能夠促進其臨床研究及應用。

在分離純化這一步我們采用半制備型HPLC對粗產(chǎn)品進行分離純化。如圖4A所示，分離純化得到的產(chǎn)品具有較高的放射化學純度且在4 h內穩(wěn)定。同時從圖4C及圖4D中的結果可以看到，除了產(chǎn)品中含有少量的抗壞血酸及其可能的氧化產(chǎn)物外，產(chǎn)品無其他化學雜質。分離得到的產(chǎn)品被加入旋轉蒸發(fā)器中除去流動相中溶劑再用生理鹽水溶解，其臨床應用安全性得到了一定的保障。另外如圖4B所示，合成得到的產(chǎn)品與19F-FETNIM標準品的保留時間一致，從色譜的角度確認本方法合成得到的產(chǎn)品是18F-FETNIM。

綜上，本研究詳細報道了18F-FETNIM的制備、分離純化及質控方法，其方法穩(wěn)定，所需合成時間短，產(chǎn)率高，且產(chǎn)品無溶劑，所得到的結果將促進18F-FETNIM的臨床推廣應用。同時一些其他18F標記正電子藥物如18F-FMISO、18F-氟乙基酪氨酸(O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine,18F-FET)、18F-氟代胸腺核苷(3’-deoxy-3’-18F-fluorothymidine,18F-FLT)的制備過程也大多包括氟化、水解、分離純化步驟[31-33]，其制備工藝與本文所報道18F-FETNIM的制備工藝類似。因此，本研究所報道的方法對其他18F標記正電子藥物的制備具有一定的指導作用。

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