張夢(mèng)宇，于萬(wàn)德

0 引 言

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)發(fā)生于糖尿病患者，引起心臟血管損害、心肌的代謝紊亂以及心肌纖維化，導(dǎo)致左心室肥厚、舒張和(或)收縮功能受損，最終進(jìn)展成心力衰竭[1-2]。糖尿病的心肌損傷可能從最初的高糖狀態(tài)下已開(kāi)始出現(xiàn),并持續(xù)整個(gè)疾病的發(fā)展，發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，可能與糖脂代謝異常、氧化應(yīng)激、交感激活、微循環(huán)障礙、心肌纖維化、自主神經(jīng)受損有關(guān)[3-4]，其中氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是主要機(jī)制之一[5-7]。氧化應(yīng)激是炎癥的主要促使因素，既往的研究證實(shí)高糖狀態(tài)誘導(dǎo)釋放大量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS),激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，隨之啟動(dòng)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎癥因子轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及平滑肌細(xì)胞增殖，造成心肌損傷，促進(jìn)糖尿病心肌病的發(fā)生[8-9]。TNF-α的抑制降低心肌纖維化，改善心臟功能。抑制NF-κB的表達(dá)可以控制促炎因子的表達(dá)，從而改善心臟功能。

黃秋葵(okra，Abelmoschus esculentus)含有獨(dú)特的多糖、黃酮等生物學(xué)活性成分，具有多種重要的藥用保健價(jià)值。黃秋葵多糖具有降低血糖、抗氧化及抗炎癥、抑制腫瘤、改善腸道菌群環(huán)境等作用[10-12]；黃秋葵的黃酮含量較高，易溶于乙醇而難溶于水[13]，在抗氧化及清除自由基方面具有顯著的作用，秋葵黃酮中的槲皮素與脂質(zhì)過(guò)氧化基(ROO)反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[14]。既往有關(guān)總黃酮的研究肯定了總黃酮在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面的作用[15]，但國(guó)內(nèi)外鮮有相關(guān)資料研究黃秋葵對(duì)糖尿病心肌病的治療作用及具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 黃秋葵總黃酮的來(lái)源及劑量秋葵果實(shí)產(chǎn)于江蘇省海安市，經(jīng)南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院鑒定為錦葵科秋葵屬黃秋葵，并提供黃秋葵總黃酮(TFA)的提取及鑒定。根據(jù)以往文獻(xiàn)證實(shí)的秋葵總黃酮足以產(chǎn)生抗氧化作用的相關(guān)劑量，本研究選擇了300 mg/kg TFA喂食小鼠，選擇1 μg/mL濃度的TFA預(yù)處理心肌細(xì)胞[16-17]。

1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法C57BL/6J小鼠，4周齡，清潔級(jí)，雄性，由南京醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院購(gòu)買(mǎi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20 ℃，濕度50%，屏蔽環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料(成分：15%豬大油，5%糖，1%膽固醇，25%膽鹽，5%蛋黃粉，49%基礎(chǔ)飼料)聯(lián)合單次鏈脲佐菌素(STZ)腹腔誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型(HFD+STZ)。將40只C57BL/6J小鼠(4周齡)按完全隨機(jī)化分組法分成4組，每組各10只。對(duì)照組：普通飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，后再予普通飼料喂養(yǎng)16周。TFA組：普通飼料喂養(yǎng)4周后，每天稱(chēng)重后通過(guò)經(jīng)口管飼法(胃管插入深度約3 cm)喂食秋葵總黃酮300 mg/kg，并普通飼料喂養(yǎng)16周。糖尿病心肌病組(STZ組)：高脂飼料喂養(yǎng)4周后，予禁食不禁水約12 h，稱(chēng)重后以100 mg/kg STZ腹腔注射1次，造模后持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)16周。造模1周后禁食不禁水12 h后稱(chēng)重，用血糖儀測(cè)量鼠尾靜脈血空腹血糖值(FBG)，F(xiàn)BG>13.9 mmol/L判斷為糖尿病小鼠造模成功。糖尿病心肌病+TFA組(STZ+TFA組)：高脂飼料喂養(yǎng)4周后，予禁食不禁水約12 h，稱(chēng)重后以100 mg/kg STZ腹腔注射1次，造模后每天稱(chēng)重后通過(guò)經(jīng)口管飼法喂食秋葵總黃酮300 mg/kg，并持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)16周。

所有小鼠于第0、造模16周時(shí)被送到南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心利用小動(dòng)物超聲Vevo 2100(Visual Sonics)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查評(píng)估左心室大小及功能。測(cè)量左室舒張末直徑 (LVIDd)、左室收縮末期直徑(LVIDs)、二尖瓣E峰與A峰之比(E/A)，Simpson法估測(cè)左室舒張末容積(LVEDV)、左室收縮末容積(LVESV)。運(yùn)用公式計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF%)以及左室短軸縮短率(LVFS%)，取3次測(cè)量的平均值。公式如下：

LVEF=[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100%

LVFS =[(LVIDd-LVIDs)/LVIDd]×100%

所有小鼠于第16周禁食不禁水約12 h后稱(chēng)量小鼠體重，取鼠尾靜脈血用血糖儀測(cè)量空腹血糖值。摘眼球取血離心得到血清，自動(dòng)化學(xué)分析儀(日本HITACHI7100)測(cè)量生化指標(biāo)。心臟重量/體重比(HW/BW)：計(jì)算公式稱(chēng)量小鼠的心臟重量與體重的比值。

應(yīng)用HE染色及Masson染色比較心肌形態(tài)及纖維化，Western blot檢測(cè)心肌蛋白p65及心肌核蛋白NF-κB、p65的表達(dá)水平。采用Trizol法提取心肌組織總RNA，qPCR檢測(cè)炎癥指標(biāo)IL-1、IL-6及TNF-α的mRNA水平。

1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法低糖對(duì)照組:低糖DMEM培養(yǎng)基(5.5 mmol/L)培養(yǎng)H9C2株心肌細(xì)胞，無(wú)其他干預(yù)。低糖+TFA組:低糖DMEM培養(yǎng)基(5.5 mmol/L)培養(yǎng)H9C2株心肌細(xì)胞，加濃度1 μg/mL TFA 1 mL。HG組:正常的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)加D-葡萄糖，配置成含葡萄糖濃度為33 mmol/L的高糖培養(yǎng)基，處理H9C2株心肌細(xì)胞2 h。HG+TFA組: 1 μg/mL TFA 1 mL預(yù)處理1 h后，高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2株心肌細(xì)胞2 h。HG+pCNDA-p65組：H9C2細(xì)胞過(guò)表達(dá)p65，再予高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。HG+TFA+pCNDA-p65組：H9C2細(xì)胞過(guò)表達(dá)p65，1 μg/mL TFA 1 mL預(yù)處理1 h后，再予高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。

H9C2細(xì)胞給予TFA、高糖對(duì)應(yīng)處理，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)比4組細(xì)胞NF-κB入核水平，應(yīng)用qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-1、IL-6、TNF-α水平。在心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)NF-κB后，比較4組細(xì)胞(HG組、HG+TFA組、HG+pCNDA-p65組及HG+TFA+pCNDA-p65組)的IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA水平。

2 結(jié) 果

2.1 秋葵總黃酮改善糖尿病小鼠的血糖與心重/體重比造模16周時(shí)，STZ組及STZ+TFA組的血糖顯著高于對(duì)照組及TFA組(P<0.05)，STZ+TFA組血糖較STZ組有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，4組的心率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。STZ+TFA組心重/體重比顯著低于STZ組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

4組小鼠的生化指標(biāo)顯示：TFA組與對(duì)照組比較肝腎功能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。STZ組較對(duì)照組腎功能(尿素氮、肌酐)顯著惡化(P<0.05)，膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇顯著升高(P<0.05)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著升高(P<0.05)。然而，TFA組與對(duì)照組、STZ+TFA組與STZ組生化指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

a：血糖；b：心率；c：心重/體重比

表 1 各組小鼠生化指標(biāo)比較

2.2秋葵總黃酮改善糖尿病小鼠的心功能STZ組較對(duì)照組左室的射血分?jǐn)?shù)(EF%)、E/A及FS%水平顯著降低(P<0.05)，左室大小(LVIDd)顯著擴(kuò)大(P<0.05)。STZ+TFA組的左室的收縮功能(EF%)、舒張功能(E/A水平及FS%水平)、左室大小(LVIDd)較STZ組均得到明顯改善(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3秋葵總黃酮緩解糖尿病小鼠的心臟重構(gòu)HE染色顯示：STZ組較對(duì)照組平滑肌增殖、內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂腫脹，STZ+TFA組較STZ組抑制了平滑肌增殖及內(nèi)皮細(xì)胞紊亂。Masson染色顯示：STZ組較對(duì)照組出現(xiàn)顯著的心肌纖維化，STZ+TFA組較STZ組抑制了心肌纖維化。見(jiàn)圖3。

2.4 秋葵總黃酮對(duì)糖尿病小鼠心肌中NF-κB的調(diào)控小鼠心臟組織的蛋白條帶顯示：與對(duì)照組比較，STZ組p-p65水平顯著升高(P<0.01)，STZ+TFA組較STZ組抑制了p-p65的升高(P<0.05)。NF-κB p65水平4組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組織細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB蛋白水平結(jié)果顯示：細(xì)胞核內(nèi)NF-κB水平STZ組較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，STZ+TFA組較STZ組抑制了細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

a：心臟超聲；b:EF%水平；c:E/A水平；d：FS%水平；e：LVIDd(mm)

圖 3 鏡下觀察各組小鼠心臟組織形態(tài)

1:對(duì)照組；2：TFA組；3：STZ組；4：STZ+TFA組

2.5秋葵總黃酮對(duì)糖尿病小鼠心肌中炎癥指標(biāo)的調(diào)控與對(duì)照組比較，STZ組IL-1、IL-6、TNF-α mRNA水平顯著升高(P<0.01)，STZ+TFA組較STZ組均顯著抑制了IL-1、IL-6、TNF-α的升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

2.6 TFA明顯減輕高糖介導(dǎo)的H9C2細(xì)胞內(nèi)NF-κB入核與炎癥因子表達(dá)不同條件下的H9C2細(xì)胞的炎癥指標(biāo)mRNA水平結(jié)果顯示：HG組IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)(P<0.01)；與HG組比較，HG+TFA組 IL-1、IL-6、TNF-α水平的上調(diào)受到抑制(P<0.05)，見(jiàn)圖6。免疫熒光檢測(cè)4組不同條件下的H9C2細(xì)胞NF-κB入核水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，HG組NF-κB入核顯著增加，而HG+TFA組較HG組顯著抑制了NF-κB入核,見(jiàn)圖7。

a:IL-1；b:IL-6；c:TNF-α

a-c分別為IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平

圖 7 NF-κB入核水平

2.7過(guò)表達(dá)NF-κB減弱TFA對(duì)高糖介導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥因子高水平的抑制與HG組比較，HG+TFA組炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著減少(P<0.05)。與HG+TFA組比較，HG+TFA+pCNDA-p65組IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，且與HG+pCNDA-p65組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TFA下調(diào)IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平的作用明顯減弱(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

*P<0.05、**P<0.01

3 討 論

秋葵富含多糖、黃酮、生物堿及微量元素等有機(jī)化學(xué)成分，近來(lái)的科學(xué)研究證實(shí)其具有抗氧化、降糖、防癌、改善菌群失調(diào)等作用[18]。秋葵總黃酮在抗氧化及清除自由基等方面具有顯著的作用[19]。本研究選擇秋葵總黃酮為研究對(duì)象，首次證實(shí)秋葵總黃酮對(duì)糖尿病心肌病的心功能和心臟重構(gòu)的改善作用，并首次證實(shí)其通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用，在動(dòng)物水平秋葵總黃酮抑制了糖尿病小鼠心肌的炎性指標(biāo)升高，在細(xì)胞水平秋葵總黃酮通過(guò)抑制心肌細(xì)胞NF-κB入核，下調(diào)其下游炎癥因子。

3.1秋葵總黃酮對(duì)血糖血脂等生化指標(biāo)的影響研究證實(shí)秋葵多糖(黏性物質(zhì))是秋葵具有降糖作用的主要有效活性成分。黃酮是一類(lèi)多酚化合物，廣泛存在于植物中，常與糖類(lèi)結(jié)合成苷，因此具有很多種類(lèi)，也具有各種各樣的藥理活性[20]。黃秋葵總黃酮中以異槲皮素和槲皮素-3-O-龍膽苷這2種多酚為主[21]。既往研究證實(shí)黃酮類(lèi)化合物500 mg/(kg·d)具有一定的降低血糖的作用，也有研究證實(shí)其可能降血壓和血脂[19]。本研究中我們應(yīng)用高脂飲食聯(lián)合單次STZ腹腔注射誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型(HFD+STZ)，構(gòu)造2型糖尿病模型。我們發(fā)現(xiàn)秋葵總黃酮300 mg/(kg·d)有輕微降糖和降脂的作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能是相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用的黃酮?jiǎng)┝枯^大，本研究的黃酮?jiǎng)┝坎粔虼蟮斤@著降低血糖。當(dāng)然，這一點(diǎn)還需要進(jìn)一步的研究去證實(shí)。

在安全性方面，我們觀察了實(shí)驗(yàn)小鼠的肝腎功能指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)300 mg/(kg·d)秋葵總黃酮無(wú)肝腎功能的損害，說(shuō)明秋葵總黃酮無(wú)毒性，安全性高。

3.2秋葵總黃酮改善糖尿病小鼠的心臟結(jié)構(gòu)及功能單味中藥總黃酮在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面的研究數(shù)量較多，但面廣而不集中，關(guān)于秋葵總黃酮對(duì)糖尿病的靶器官保護(hù)方面的研究甚少，僅有一篇報(bào)道秋葵總黃酮改善糖尿病腎病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的左心室舒張末直徑、收縮末直徑顯著擴(kuò)大，EF值下降，舒張功能下降，證實(shí)模型組出現(xiàn)糖尿病心肌病變以及心功能惡化，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符。本研究進(jìn)一步證實(shí)秋葵總黃酮明顯改善了糖尿病心肌病小鼠的心臟大小及功能，在器官水平表現(xiàn)為心臟左心室舒張末直徑縮小、EF值升高，在組織水平表現(xiàn)為心肌內(nèi)皮細(xì)胞腫脹受損和平滑肌細(xì)胞的增殖減少、心肌纖維化水平降低。

3.3秋葵總黃酮抑制炎癥反應(yīng)炎癥損傷是糖尿病心肌病的重要病理機(jī)制[23-26]。本研究發(fā)現(xiàn)秋葵總黃酮降低血糖不明顯，但能顯著抑制糖尿病心肌病的發(fā)生及進(jìn)展，考慮作用機(jī)制與血糖的直接影響無(wú)關(guān)，而是獨(dú)立于降糖以外的其他機(jī)制，抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)從而改善糖尿病心肌病。

黃酮在清除自由基和抗氧化方面具有顯著作用，能夠保護(hù)心臟及抗衰老、防癌、改善血液循環(huán)等。有研究提示秋葵總黃酮通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)改善糖尿病腎病[20]。我們研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的心肌細(xì)胞中NF-κB表達(dá)增加，細(xì)胞核中NF-κB表達(dá)增加，也就是NF-κB的入核增加，同時(shí)，心肌細(xì)胞中IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著增加。這與既往糖尿病機(jī)制的結(jié)果一致。給予秋葵總黃酮后小鼠心肌組織與細(xì)胞核中NF-κB表達(dá)下降，心肌組織內(nèi)IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯下調(diào)。我們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)秋葵總黃酮能抑制高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞NF-κB入核，并下調(diào)細(xì)胞內(nèi)IL-1、IL-6、TNF-α水平，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們?cè)谛募〖?xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)NF-κB后，發(fā)現(xiàn)秋葵總黃酮不能再下調(diào)高糖刺激引起的高水平IL-1、IL-6、TNF-α，證實(shí)秋葵總黃酮是通過(guò)影響NF-κB繼而影響下游的IL-1、IL-6、TNF-α水平。這些結(jié)果首次證實(shí)秋葵總黃酮通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)抑制糖尿病小鼠的心室重構(gòu)，從而抑制糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展。

秋葵總黃酮降低糖尿病小鼠的炎癥指標(biāo)，改善心功能和心室重構(gòu)其可能機(jī)制是通過(guò)抑制細(xì)胞NF-κB入核下調(diào)炎癥水平。