晚 麗，李作孝

0 引 言

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種自身免疫性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細胞浸潤及多灶性脫髓鞘為主要病理特征[1]。全球大約有250萬的MS患者，是青年人致殘的重要疾病之一[2]。MS發(fā)病原因不詳，機制復雜，多項研究表明炎癥誘導的氧化應激在MS脫髓鞘及軸突損傷中起著重要作用，是推動疾病進展的主要機制之一，抑制氧化應激可阻礙MS病程進展[3]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS的最常用動物模型[1]。核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶(nuclear factor-erythroid-2 related factor-2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO-1)是機體內(nèi)重要的抗氧化調(diào)節(jié)通路，激活后可起到抗氧化、抗炎、穩(wěn)定線粒體、調(diào)控細胞死亡等作用[4]。依達拉奉是一種抗氧化劑，有研究顯示依達拉奉可通過上調(diào)Nrf2及HO-1表達抑制氧化應激，從而緩解EAE大鼠臨床癥狀[5]。依達拉奉右莰醇是在依達拉奉基礎上加入了右莰醇的復方制劑，有研究表明其具有更強的抗氧化應激作用[6]。但目前關于依達拉奉右莰醇是否通過調(diào)控Nrf2/HO-1表達影響EAE小鼠疾病進展筆者暫未見報道。本實驗通過依達拉奉右莰醇干預EAE小鼠，觀察依達拉奉右莰醇對EAE小鼠的作用并探討其機制是否與Nrf2/HO-1有關，為MS的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雌性C57BL/6小鼠40只，SPF級，6～8周齡，體重(20±2)g，由湖北實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2020-0018。飼養(yǎng)條件：室溫(24±2)℃，濕度50%左右，12 h光/暗循環(huán)，自由進食及飲水。實驗前適應性喂養(yǎng)1周。倫理編號：2021-0601-3。

1.2藥品及試劑依達拉奉右莰醇注射用濃溶液(南京先聲東元制藥有限公司)；依達拉奉注射液(上海麥克林生化科技有限公司)；MOG35-55多肽(國泰生物)；結(jié)核桿菌H37Ra(BD公司)；完全弗式佐劑、百日咳毒素均購自美國sigma公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗Nrf2抗體(CST公司)；兔抗HO-1、GAPDH抗體(abcam公司)，HRP標記的山羊抗兔IgG(Aspen公司)。

1.3分組、造模及干預采用隨機數(shù)字表法將40只小鼠分為空白對照組、EAE模型組、依達拉奉右莰醇干預組以及依達拉奉干預組，各10只。參照文獻[7]方式造模，將MOG35-55多肽稀釋為5 g/L，加入相同體積含結(jié)核桿菌的完全弗氏佐劑(結(jié)合桿菌最終濃度為5 g/L)。推打形成油包水型乳劑，在后3組小鼠脊椎旁任選4點進行皮下注射(每只0.1 mL)，空白對照組注射等量等滲鹽水。在免疫的第0和48小時，后3組腹腔注射0.5 mL百日咳毒素(200 ng/只)，空白對照組注射等量等滲鹽水。自造模次日起，依達拉奉右莰醇干預組及依達拉奉干預組分別腹腔注射依達拉奉右莰醇12.5 mg/kg及依達拉奉10 mg/kg，空白對照組及EAE模型組注射等量等滲鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。

1.4小鼠發(fā)病情況觀察小鼠免疫后，每日同一時間由兩位實驗員分別對各組小鼠進行神經(jīng)功能障礙評分，評分采用Benson評分標準：0分(無癥狀)；1分(尾部下垂)；2分(雙后肢無力)；3分(雙后肢癱)；4分(四肢癱)；5分(瀕死狀態(tài)或死亡)；介于兩項之間者以±0.5計分。并記錄小鼠的進食、飲水、活動、毛發(fā)、體重等情況。以評分1～5分判定為小鼠發(fā)病，造模到開始發(fā)病時間記為潛伏期，開始發(fā)病到發(fā)病高峰期(連續(xù)3日神經(jīng)功能障礙評分不增加)記為進展期，發(fā)病小鼠于發(fā)病高峰期處死，未發(fā)病小鼠及空白對照組小鼠觀察到造模后28 d處死，取脊髓和腦室周圍組織。一部分脊髓組織浸泡在4%多聚甲醛中充分固定24 h并制成4 μm和6 μm石蠟切片，腦組織和另一部分脊髓組織放在-80 ℃冰箱中備用，分別用于生化分析和Western blot檢測。

1.5脊髓組織病理學檢查每組隨機選取3張4 μm石蠟切片進行HE染色，檢測炎性細胞浸潤情況(依次進行脫蠟、蘇木精染色、伊紅染色、脫水封片、鏡下觀察并拍照)。另外選取3張6 μm石蠟切片進行LFB染色，檢測脫髓鞘情況(依次進行脫蠟、醇化、Luxol Fast Blue染液中染色、分化、鏡檢、風干、封固、鏡下觀察并拍照)。

1.6生化檢測腦組織勻漿中氧化應激指標水平取凍存腦室周圍腦組織0.5 g，冰水洗滌，切割，等滲鹽水稀釋至十倍，制成腦組織勻漿。然后以離心半徑18 cm，3000 r/min離心15 min以收集上清液。按試劑盒說明測定MDA(比色法)、ROS(化學發(fā)光法)含量及SOD(黃嘌呤氧化酶法)、CAT(紫外分光法)活性。

1.7 Westernblot檢測脊髓組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平取小鼠凍存脊髓組織，清洗，提取蛋白，使用BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白濃度。按照樣品濃度計算上樣體積，每孔40 μg蛋白，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，SDS-PAGE電泳。使用甲醇活化PVDF膜后進行常規(guī)轉(zhuǎn)膜操作。轉(zhuǎn)好的膜使用封閉液在常溫下處理1 h，加入稀釋好的一抗[兔抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶2000)、GAPDH(1∶10 000)抗體]4 ℃過夜，回收一抗，沖洗，再加入稀釋好的二抗(HRP標記的山羊抗兔抗體，1∶10 000)，室溫孵育30 min，進行ECL反應，暗室曝光。最后用AlphaEaseFC軟件分析，以GAPDH為內(nèi)參，得出蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠行為學比較空白對照組均無異常表現(xiàn)，其余各組不同程度發(fā)病。發(fā)病小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲下降、體重減輕等情況，神經(jīng)系統(tǒng)障礙依次出現(xiàn)尾部張力下降、后肢癱瘓伴或不伴有前肢癱瘓、雙便失禁等臨床表現(xiàn)。與EAE模型組相比，依達拉奉右莰醇干預組及依達拉奉干預組發(fā)病潛伏期延長、進展期縮短、高峰期神經(jīng)功能障礙評分降低，依達拉奉右莰醇干預組更明顯(P<0.05)，見表1。

表 1 各組小鼠行為學比較

2.2各組小鼠脊髓組織病理學改變空白對照組脊髓組織未見異常；EAE模型組發(fā)病高峰期脊髓組織可見大量炎性細胞浸潤，以單核細胞浸潤為主，脊髓白質(zhì)可見大片白色脫髓鞘區(qū)域，脊髓組織嚴重腫脹及空泡形成。給予依達拉奉右莰醇及依達拉奉干預后脊髓組織炎性細胞浸潤及脫髓鞘情況減輕，依達拉奉右莰醇干預組最輕。見圖1。

2.3各組小鼠腦組織勻漿中氧化應激指標水平比較與空白對照組相比，EAE模型組腦組織勻漿中MDA和ROS含量升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)。與EAE模型組相比，依達拉奉右莰醇及依達拉奉干預組腦組織勻漿中MDA和ROS含量降低，SOD和CAT活性升高，依達拉奉右莰醇干預組效果更明顯(P<0.05)。見表2。

2.4 各組小鼠脊髓組織中Nrf2和HO-1表達水平比較與空白對照組相比，EAE模型組脊髓組織中Nrf2及HO-1表達水平升高(P<0.05)；與EAE模型組相比，依達拉奉右莰醇干預組及依達拉奉干預組脊髓組織中Nrf2及HO-1表達水平升高，依達拉奉右莰醇干預組升高更明顯(P<0.05)。見表3，圖2。

圖 1 各組小鼠脊髓組織病理學改變

表 2 各組小鼠腦組織勻漿中氧化應激指標水平比較

表 3 各組小鼠脊髓組織中Nrf2和HO-1表達水平比較

1：空白對照組；2：EAE模型組；3：依達拉奉右莰醇干預組；4：依達拉奉干預組

2.5 各組小鼠脊髓組織中Nrf2、HO-1表達水平與腦組織勻漿中氧化應激指標水平的相關性分析各組小鼠脊髓組織中Nrf2、HO-1表達水平與腦組織勻漿中SOD、CAT活性呈正相關，與腦組織勻漿中MDA、ROS含量呈負相關(P<0.05)，見表4、表5。

表 4 各組小鼠Nrf2表達水平與氧化應激指標水平的相關性

表 5 各組小鼠HO-1表達水平與氧化應激指標水平的相關性

3 討 論

MS是一種神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，致殘率高，給患者及家庭帶來了極大負擔[2]。MS急性期治療主要以激素沖擊及丙種球蛋白為主，價格昂貴且副作用多，多種疾病修飾藥物禁忌癥較多[8]，故尋找安全有效的治療藥物是目前研究的重點。依達拉奉是一種神經(jīng)保護劑，其具有副作用少，機體耐受好等優(yōu)勢，是目前臨床缺血性腦卒中的一線治療藥物[9]。除此之外，依達拉奉在自身免疫性疾病中也有廣泛研究，許多證據(jù)表明依達拉奉可抑制EAE的發(fā)生發(fā)展，可能是通過抗氧化、抑制炎性細胞浸潤及炎癥因子表達、促進髓鞘再生等發(fā)揮作用，其中抗氧化起主導作用[5，10]。同時有研究證明依達拉奉和右莰醇以4∶1比例組成的復方制劑依達拉奉右莰醇中兩種成分具有協(xié)同增效作用，使其具有比依達拉奉更強的抗氧化效應[6]。但目前關于依達拉奉右莰醇對EAE小鼠的作用筆者暫未見文獻報道。EAE小鼠是研究MS常用的動物模型，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)MOG35-55多肽免疫后的小鼠逐漸精神不振、體重下降及不同程度身體癱瘓，病理檢測發(fā)現(xiàn)脊髓組織大量炎癥細胞浸潤及大片髓鞘脫失，與人類的MS臨床及病理表現(xiàn)相似，提示造模成功。經(jīng)依達拉奉右莰醇及依達拉奉干預后，小鼠發(fā)病潛伏期延長、進展期縮短、高峰期神經(jīng)功能評分降低、脊髓炎性細胞浸潤及脫髓鞘程度減輕，依達拉奉右莰醇干預組效果更明顯。說明依達拉奉右莰醇對EAE小鼠具有神經(jīng)保護作用，且作用強于依達拉奉。生理狀況下，機體氧化-抗氧化趨于平衡。在MS病理過程中，炎癥誘導的活化免疫細胞、脫髓鞘產(chǎn)生的鐵沉積、線粒體功能障礙等都可導致ROS產(chǎn)生增加，過量產(chǎn)生的ROS消耗抗氧化酶，導致氧化-抗氧化失衡[3]。ROS不僅可直接破壞機體內(nèi)的脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)，產(chǎn)生過多的過氧化物，如MDA[11]；還可以啟動細胞凋亡、促進髓鞘吞噬、增加血腦屏障的通透性，并促進淋巴細胞向中樞遷移[12]；除此之外，ROS還可激活炎癥轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(nuclear factor κB,NF-кB)，啟動炎癥級聯(lián)反應[13]。多種途徑共同作用最終導致MS進展。有研究發(fā)現(xiàn)MS患者腦脊液中存在大量脂質(zhì)過氧化物[14]，且ROS水平明顯升高[15]。SOD和CAT作為機體重要的抗氧化酶，可快速清除ROS減少氧化損傷[16]。Singh等[17]研究發(fā)現(xiàn)依達拉奉可清除自由基，上調(diào)抗氧化酶SOD和CAT表達。同時有研究顯示依達拉奉右莰醇具有比依達拉奉更強的自由基清除效應[6]。本實驗發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，EAE模型組腦組織勻漿中ROS和MDA含量顯著升高，SOD和CAT活性顯著降低，進一步證實EAE發(fā)病高峰期存在氧化應激損傷。經(jīng)依達拉奉右莰醇及依達拉奉干預均可降低腦組織勻漿中ROS和MDA含量，升高SOD和CAT活性，且依達拉奉右莰醇干預組更明顯。提示依達拉奉右莰醇對EAE小鼠的保護作用可能與上調(diào)抗氧化酶表達，清除ROS，從而抑制氧化應激有關，其作用效果強于依達拉奉。

Nrf-2是抗氧化關鍵調(diào)節(jié)因子，在氧化應激條件下，與細胞質(zhì)中抑制蛋白Keap-1解離，磷酸化后迅速轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)與一種小Maf蛋白形成異二聚體，最后與抗氧化反應原件(activating response element，ARE)結(jié)合，調(diào)控下游相關的基因表達，發(fā)揮各種生理作用，如調(diào)控抗氧化酶SOD、CAT以及II相解毒酶HO-1等的表達，SOD和CAT可快速清除體內(nèi)ROS[18]，HO-1可還原膽紅素為膽綠素，并產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧物質(zhì)CO和Fe+,共同起到抗氧化作用[19]。因此Nrf-2成為抗氧化干預的靶點。Nrf2在EAE中廣泛研究，Nellessen等[20]研究表明Nrf2基因敲除的EAE小鼠出現(xiàn)更嚴重的氧化應激及神經(jīng)炎癥，并且脫髓鞘、軸突損傷和神經(jīng)元變性更明顯。同時Long等[16]研究表明激活Nrf-2對EAE具有防治作用。張巧蓮等[5]研究顯示依達拉奉可通過上調(diào)Nrf-2及HO-1表達抑制氧化應激，從而對EAE大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Shou等[21]研究表明在毒死蜱誘導的神經(jīng)損傷中，依達拉奉也可通過激活Nrf-2，上調(diào)SOD表達，并降低ROS和MDA含量發(fā)揮神經(jīng)保護作用。以上證據(jù)均證明依達拉奉可通過激活Nrf-2抑制氧化應激。依達拉奉右莰醇被證實抗氧化作用強于依達拉奉[6]，但其抗氧化機制是否與Nrf-2/HO-1相關尚不明確。本實驗發(fā)現(xiàn)EAE模型組脊髓組織中Nrf-2和HO-1表達水平高于空白對照組，與前人研究一致，可能原因是EAE發(fā)病高峰期氧化應激可以激活Nrf2/ARE通路，并誘導Nrf2及HO-1的表達[16]。經(jīng)過依達拉奉右莰醇及依達拉奉干預后，脊髓組織中Nrf-2和HO-1表達水平均較EAE模型組升高，且依達拉右莰醇組升高更加明顯。同時，對Nrf-2、HO-1表達水平與氧化應激指標水平的相關性分析顯示：Nrf-2、HO-1變化趨勢與SOD、CAT基本相同，與MDA、ROS基本相反。表明依達拉奉右莰醇可能通過調(diào)控Nrf-2/HO-1表達，提高抗氧化酶活性，降低機體氧化水平，抑制脂質(zhì)過氧化，從而對EAE小鼠具有保護作用，且效果強于依達拉奉。

綜上所述，依達拉奉右莰醇對EAE小鼠具有神經(jīng)保護作用，且作用強于依達拉奉。可能原因是依達拉奉右莰醇對Nrf2/HO-1具有更強的調(diào)控作用，更能上調(diào)抗氧化酶表達，抑制脂質(zhì)過氧化水平。本文初步探索了依達拉奉右莰醇對EAE小鼠發(fā)揮保護作用的機制，但其保護作用是否還涉及其他機制還需進一步研究。