袁梓博，方紅波，李 濤，馮泉?jiǎng)P，曹勝利，李 捷

0 引 言

胰腺或胰島移植是治療糖尿病的有效方法，可以控制血糖及其相關(guān)并發(fā)癥[1-2]。目前，供胰主要源自腦死亡供體的捐獻(xiàn)。然而，研究發(fā)現(xiàn)腦死亡誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和促凝介質(zhì)大量釋放入血，激活全身炎性反應(yīng)[3-4]。同樣，腦死亡供胰中炎性介質(zhì)表達(dá)上調(diào)，激活炎性反應(yīng)[5]。促炎介質(zhì)過早表達(dá)可促進(jìn)移植過程中的炎性反應(yīng)，加重缺血再灌注損傷，增加移植術(shù)后排斥和移植物功能障礙發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，反-肉桂酰-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-酰胺三氟乙酸鹽(Trans-Cinnamoyl-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-amide trifluoroacetate salt，TCY-NH2)是肽類化合物，能抑制BALB/c小鼠體內(nèi)中性粒細(xì)胞向胸膜腔的遷移，并減少中性粒細(xì)胞的滾動(dòng)和黏附，降低炎性反應(yīng)[7]。TCY-NH2可減弱血小板及免疫細(xì)胞的募集，改善缺血再灌注損傷[8]。TCY-NH2對胰腺炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡作用尚不明確，本研究擬通過構(gòu)建大鼠腦死亡模型，探討TCY-NH2作為干預(yù)靶點(diǎn)對腦死亡供胰的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性SD大鼠18只，健康SPF級，體重300～350g，購自鄭州華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[動(dòng)物許可證號: SCXK(豫)2019-0002]。所有大鼠均飼養(yǎng)在環(huán)境溫度19～23 ℃，相對濕度 50% ～ 60%清潔動(dòng)物房內(nèi)，自由進(jìn)食飲水。

1.2腦死亡模型采用緩慢間斷顱內(nèi)加壓法誘導(dǎo)大鼠腦死亡，主要方法：戊巴比妥鈉腹腔注射誘導(dǎo)麻醉，顱骨鉆孔，硬腦膜外放置擴(kuò)張導(dǎo)管球囊以加壓誘導(dǎo)腦死亡，氣管切開插管以備自主呼吸停后連接呼吸機(jī)，股動(dòng)脈置管監(jiān)測血壓，尾靜脈置管補(bǔ)液，膀胱造瘺監(jiān)測尿量。當(dāng)出現(xiàn)自主呼吸消失、角膜反射消失、深昏迷、腦電圖波形平直時(shí)，判定大鼠腦死亡誘導(dǎo)成功。腦死亡期間，持續(xù)呼吸機(jī)通氣，靜脈輸入羥乙基淀粉氯化鈉注射液，維持平均動(dòng)脈壓>80 mmHg。

1.3實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)將18只大鼠分為3組：腦死亡組，采用上述方法構(gòu)建大鼠腦死亡模型，維持腦死亡狀態(tài)6 h；假手術(shù)組，除不加壓誘導(dǎo)腦死亡，余操作同腦死亡組；TCY-NH2組，在加壓誘因腦死亡時(shí)將TCY-NH2(0.6 mg/kg，溶于等滲鹽水)通過靜脈注入大鼠體內(nèi)，其余操作同腦死亡組。在腦死亡6 h后留取胰腺標(biāo)本。

1.4免疫組化染色采用免疫組化染色法檢測胰腺組織中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，以分析中性粒細(xì)胞浸潤情況。石蠟包埋胰腺組織，切片4 μm厚，脫蠟、水化，EDTA(Ph9.0)液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%胎牛血清進(jìn)行封閉，孵育MPO抗體(1∶200，武漢賽維爾)，孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB顯色，封片。陽性為棕黃色，每個(gè)切片至少選3個(gè)視野進(jìn)行分析。

1.5熒光實(shí)時(shí)定量PCR采用RNAiso Plus試劑盒(Takara)提取胰腺組織中總RNA，并用Nanodrop 2000測得RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)操作說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus，Takara)試劑盒操作說明配置反應(yīng)體系，并在ABI7500快速實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行檢測。每個(gè)樣本重復(fù)3次，GAPDH作為相對表達(dá)的內(nèi)參基因。PCR中所用的基因引物：GAPDH引物5′- CTTGTGCAGTGCCAGCCTC-3′(上游)和5′-ATGAAGGGGTCGTTGATGGC-3′(下游)，IL-1β引物5-AGGAGAGACAAGCAACGACA-3′(上游)和5′-TTGTTTGGGATCCACACTCTCC-3′(下游)，TNF-α,引物5′- GTGATCGGTCCCAACAAGGA-3′(上游) 和5′- CGCTTGGTGGTTTGCTACG-3′(下游)，VCAM-1引物5′-GGAAATGCCACCCTCACCTT-3′(上游)和5′- AACAGTAAATGGTTTCTCTTGAACA-3′(下游)，ICAM-1引物5′- AAGCTCTTCAAGCTGAGCGA-3′(上游)和5′-CGCTCTGGGAACGAATACAC-3′(下游)。

1.6Western blot分析用磷酸化蛋白提取試劑盒(索萊寶)提取胰腺組織的總蛋白，并用上樣緩沖液煮沸變性。根據(jù)目的蛋白分子大小選用12% 或15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)染至PVDF膜。用一抗p-IκBα 抗體(Cell Signaling Technology 公司), p-p65 抗體(Cell Signaling Technology公司)、IκBα 抗體(Proteintech 公司)、Bcl2抗體(Proteintech公司)、Bax抗體(Proteintech公司)、cl-Caspase-3抗體 (Proteintech公司) 和GAPDH抗體 (Proteintech公司)孵育4 ℃過夜，二抗孵育后用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯像，用C-DiGit印跡掃描儀進(jìn)行檢測并用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。GAPDH為上樣內(nèi)參蛋白。

1.7細(xì)胞凋亡檢測將石蠟包埋胰腺組織切片，厚4 μm，采用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(賽維爾)檢測胰腺組織的凋亡細(xì)胞(呈綠色)，用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色(呈藍(lán)色)。熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)切片至少選3個(gè)視野進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺組織中性粒細(xì)胞浸潤情況與腦死亡組胰腺組織浸潤的中性粒細(xì)胞(4.20±2.79)比較，TCY-NH2組、假手術(shù)組(0.70±1.00、0.40±0.66)明顯減少(P<0.05)。這表明TCY-NH2可以減輕腦死亡供胰組織的中性粒細(xì)胞浸潤情況。見圖1。

a:假手術(shù)組; b:腦死亡組; c:TCY-NH2組

2.2胰腺組織中炎癥介質(zhì)的表達(dá)情況與腦死亡組比較，TCY-NH2組、假手術(shù)組的胰腺組織中IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。這表明阻斷TCY-NH2可以降低腦死亡供胰組織中炎性介質(zhì)的表達(dá)。見表1。

2.3胰腺組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白的變化與腦死亡組比較，TCY-NH2組、假手術(shù)組的胰腺組織中p-IκBα和p-p65的蛋白表達(dá)明顯降低，IκBα蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。這表明TCY-NH2可以抑制腦死亡供胰組織中NF-κB通路激活。見圖2。

表 1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測胰腺組織中細(xì)胞因子的mRNA相對表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與腦死亡組比較，#P<0.05

2.4胰腺組織中細(xì)胞凋亡情況與腦死亡組的胰腺組織中細(xì)胞凋亡(2.50±1.96)比較，TCY-NH2組、假手術(shù)組(0.60±0.66、0.30±0.46)明顯減少(P<0.05)。這表明TCY-NH2可以減輕腦死亡供胰組織中細(xì)胞凋亡。見圖3。

a:假手術(shù)組; b:腦死亡組; c:TCY-NH2組

2.5胰腺組織中凋亡相關(guān)蛋白的變化與腦死亡組比較，TCY-NH2組、假手術(shù)組的胰腺組織中Bax和cl-Caspase3的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bcl2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。這表明TCY-NH2可以調(diào)控腦死亡供胰組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。見圖4。

與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與腦死亡組比較，#P<0.05

3 討 論

全身炎性反應(yīng)是腦死亡供體的重要特征，影響腦死亡供體器官的質(zhì)量和移植效果[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道：腦死亡病人的血清中IL-1和TNF-α濃度明顯升高，胰腺組織TNF-α蛋白表達(dá)上調(diào)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)腦死亡大鼠胰腺組織中炎癥相關(guān)基因IL-1β、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1表達(dá)上調(diào)，中性粒細(xì)胞浸潤明顯增多，NF-κB通路被激活。這些研究結(jié)果顯示腦死亡引起了供體胰腺組織中的炎性反應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證腦死亡可以引起全身炎性反應(yīng)。腦死亡階段激活的炎性反應(yīng)可以導(dǎo)致胰腺損傷。胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑Exendin-4預(yù)處理腦死亡大鼠，可以下調(diào)胰腺組織中IL-1β基因表達(dá)，增強(qiáng)胰島細(xì)胞的活力及葡萄糖刺激后胰島素分泌能力[9]。IL-1受體拮抗劑預(yù)處理腦死亡大鼠，可以下調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞的遷移和激活，改善細(xì)胞線粒體功能障礙，提高胰島活力及移植效果[10]。然而，目前這些干預(yù)方法尚未應(yīng)用于臨床，仍需探索新的治療方式。

本研究發(fā)現(xiàn)用TCY-NH2處理腦死亡大鼠，可以減輕腦死亡大鼠胰腺組織的炎性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤減少、細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1)表達(dá)下調(diào)、NF-κB通路被抑制(p-IκBα和p-p65的蛋白表達(dá)明顯降低，IκBα蛋白表達(dá)明顯升高)。NF-κB信號是炎性反應(yīng)中的經(jīng)典通路，炎性信號刺激細(xì)胞后，胞內(nèi)的IκB發(fā)生磷酸化，隨后被蛋白酶降解以釋放NF-κB，促使NF-κB激活并轉(zhuǎn)至細(xì)胞核[11]；p65是NF-κB的重要組分，其磷酸化可增強(qiáng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，參與機(jī)體炎性反應(yīng)[12]。ICAM-1和VCAM-1是介導(dǎo)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附的重要分子，促進(jìn)白細(xì)胞游走并參與炎性反應(yīng)[13-14]。我們認(rèn)為上調(diào)的ICAM-1和VCAM-1參與腦死亡供體胰腺組織中的中性粒細(xì)胞浸潤。中性粒細(xì)胞作為血液中占比最高的白細(xì)胞，是急性期炎性反應(yīng)的參與者，釋放促炎細(xì)胞因子以募集白細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，參與糖尿病人胰腺及相關(guān)靶組織的病理進(jìn)展過程[15]。綜上，我們認(rèn)為TCY-NH2通過抑制NF-κB通路，下調(diào)炎性因子表達(dá)，減少中性粒細(xì)胞募集，降低腦死亡供體胰腺組織中的炎性反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)腦死亡大鼠胰腺組織中細(xì)胞凋亡明顯增加、cl-Caspase3蛋白明顯上調(diào)，與我們之前在腦死亡供體肝臟中的研究發(fā)現(xiàn)一樣[16]。腦死亡供體胰腺中上調(diào)的IL-1β和TNF-α可能引起細(xì)胞凋亡的重要誘因。文獻(xiàn)報(bào)道：IL-1β在腦死亡供胰獲取、分離、培養(yǎng)、植入過程大量產(chǎn)生，能啟動(dòng)或放大急性炎性反應(yīng)，減少胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素的合成和分泌或引起胰島β細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致移植失敗[17]；TNF-α是經(jīng)典的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)分子，與其受體結(jié)合后激活胰腺細(xì)胞凋亡[18]。下調(diào)或阻斷這些炎性介質(zhì)可以減輕炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，然而目前鮮有臨床干預(yù)方法。

本研究發(fā)現(xiàn)用TCY-NH2處理腦死亡大鼠，可以減輕腦死亡大鼠胰腺組織中細(xì)胞凋亡，明顯下調(diào)Bax和cl-Caspase3的蛋白表達(dá)，明顯上調(diào)Bcl2蛋白表達(dá)。Bax蛋白在線粒體外膜形成低聚體，參與細(xì)胞色素C的釋放，促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡；相反Bcl2蛋白通過阻斷Bax蛋白低聚反應(yīng)，抑制線粒體細(xì)胞凋亡途徑；Caspase3在凋亡過程中被降解剪切成活性形式，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白；過表達(dá)Bcl2、敲除Bax或抑制Caspase3均可抑制細(xì)胞凋亡[19]。有研究表明：TCY-NH2是選擇性PAR4拮抗肽，可抑制小鼠顱腦損傷組織中細(xì)胞凋亡[20]；敲除PAR4基因抑制了小鼠心肌缺血再灌注中的細(xì)胞凋亡和Caspase3蛋白活性，同時(shí)上調(diào)Bcl2蛋白表達(dá)水平[21]。因此，我們認(rèn)為TCY-NH2能減輕腦死亡誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明TCY-NH2可以減輕腦死亡供體胰腺中炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，為提高腦死亡供胰質(zhì)量提供潛在的干預(yù)方法。