陳東杰，于懷智，鄧秀麗，張長峰，孫崇德,3

（1.國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250103；2.山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點實驗室，山東濟(jì)南 250103；3.浙江大學(xué)，浙江杭州 310027）

番茄生命周期相對較短，品種類型豐富，口感酸甜，遺傳體系較為完善，是分析果實發(fā)育、成熟、貨架保鮮、品質(zhì)保持以及遺傳基因等機(jī)制的優(yōu)良材料[1]。但番茄屬于呼吸躍變型果實[2]，生長和采收期正值夏季高溫高濕季節(jié)，采后果實極易軟化腐爛，且易受多種病害侵染，不耐貯藏，從而失去商品價值和研究價值。研究發(fā)現(xiàn)采摘和采后貯藏過程中的不當(dāng)操作，即使造成的損失非常微小或肉眼不可見，也會加速果實的軟化[3-4]?？刂坪貌珊蠓训馁A藏條件對提高番茄貯藏品質(zhì)至關(guān)重要。

目前國內(nèi)外已研究涂膜保鮮技術(shù)、1-MCP 處理、低溫處理、添加抗氧化劑等[5-8]對番茄貯藏的影響，但關(guān)于濕度對番茄貯藏品質(zhì)影響的研究較少，而保持適宜的相對濕度也是控制和保持果實貯藏品質(zhì)的有效方法之一。如黃振喜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，90%～100%相對濕度貯藏環(huán)境下的棗果，個頭更加飽滿，脆性更高。蓋曉陽等[10]研究得出，高濕度的貯藏環(huán)境可以減輕西葫蘆的氧化損傷，提高貯藏品質(zhì)。Mari 等[11]研究表明，85%～90%的相對濕度可以顯著降低臍橙果皮的褐變率，增加臍橙的貯藏期。

同時，為了提高應(yīng)對外界環(huán)境變化的能力，減少植物體內(nèi)水分的流失，大多數(shù)高等植物器官的表面都被角質(zhì)層所覆蓋[12]。角質(zhì)層作為植物的一級保護(hù)屏障，主要是由多酶復(fù)合物參與一系列酶促反應(yīng)合成的，其調(diào)控機(jī)制受基因序列SlSHINE3因子含量的影響[13-14]。Ladaniya[15]研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)能影響柑橘的保存期。郜海燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，損傷外表皮角質(zhì)層的藍(lán)莓更易發(fā)生軟化衰老。相關(guān)研究者對果實角質(zhì)層的研究表明，相對濕度的變化會影響果實表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成的變化，從而影響果實的品質(zhì)。江英等[14]研究發(fā)現(xiàn)，高貯藏濕度對于保持香梨表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分、延長果實采后貯藏品質(zhì)具有正向作用。Jana 等[17]研究表明，番茄果實不同發(fā)育階段蠟質(zhì)組分的變化與角質(zhì)層蒸騰有著直接的關(guān)系。但目前在番茄貯藏方法研究中，涉及不同濕度對番茄貯藏品質(zhì)影響的文獻(xiàn)甚少。本文研究了不同貯藏濕度對番茄品質(zhì)、番茄表皮及角質(zhì)層結(jié)構(gòu)、SlSHINE3轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的影響，從基因水平探討了不同濕度對番茄貯藏品質(zhì)的影響，為番茄采后貯藏保鮮提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的‘漢蒙7 號’番茄購買于濟(jì)南市七里堡蔬菜批發(fā)市場。番茄采摘后4 ℃冷藏車運(yùn)送至國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心。挑選成熟度一致、形狀均勻、無病蟲、無機(jī)械損傷的番茄。

檸檬酸、檸檬酸鈉、硼酸、硼砂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸，分析純，均購買于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（酶活1 000 U/mg）、纖維素酶（酶活25 U/mg），上海金穗生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，大連TaKaRa 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RX-2 智能型人工氣候培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；T9S 紫外可見光分光光度計，北京普析通用有限公司；CR-400 色彩色差計，日本柯尼卡美能達(dá)控股公司；質(zhì)構(gòu)儀，TMS-TOUCH 型，美國FTC 公司；高速冷凍離心機(jī)，D-78532 型，德國Hettich 科技有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱，HZL-280 型，太倉市強(qiáng)樂實驗設(shè)備有限公司。

1.3 實驗設(shè)計

本試驗共分為2 組處理，在溫度15±0.5 ℃下，將番茄在相對濕度分別為50%±5%、100%±5%的條件下貯藏18 d。每隔3 d 觀測一次番茄失水率、可溶性固形物含量、色差、質(zhì)構(gòu)、多酚氧化酶活性、過氧化物酶活性、丙二醛含量以及角質(zhì)層的形態(tài)結(jié)構(gòu)、SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 失重率

隨機(jī)挑選10 個番茄，每隔3 d 測定一次總質(zhì)量并記錄，按照公式（1）計算失重率。

式中，m1為前一次稱量的番茄總質(zhì)量，g；m2為后一次稱量的番茄總質(zhì)量，g。

1.4.2 可溶性固形物（SSC）含量

隨機(jī)挑選6 個完好的番茄，每個番茄均勻的選取3個點，用藥匙取適量番茄汁滴于手持糖度計的檢測鏡上，記錄數(shù)據(jù)。按同樣的方法平行操作6 次，取平均值，單位以%計。

1.4.3 多酚氧化酶（PPO）活性

按照范三紅等[18]的方法進(jìn)行測定。

1.4.4 過氧化物酶（POD）活性

按照王麗等[19]的方法進(jìn)行測定。

1.4.5 丙二醛（MDA）含量

按照彭鷗等[20]的方法進(jìn)行測定。

1.4.6 角質(zhì)層的提取及形態(tài)學(xué)觀察

取直徑2.5cm的圓形番茄果皮于燒杯中，加入10mL含1.5%纖維素酶、1.5%果膠酶的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH 4.0，含0.01%NAN3）。將燒杯放置在35 ℃恒溫緩慢旋轉(zhuǎn)的振蕩器中（100 r/min），酶解24 h 后取出，角質(zhì)層用蒸餾水沖洗掉表面黏附的表皮細(xì)胞及果肉，改用硼酸緩沖液（pH 9.0）清洗，以除去黏附在角質(zhì)層的酸性物質(zhì)如酚類、脂肪酸等，直到硼酸液保持澄清。最后，分離的角質(zhì)層用蒸餾水洗滌，自然晾干，貯存于1～4 ℃冰箱中備用，在電子顯微鏡下觀察其形態(tài)變化并拍照。

1.4.7 電鏡掃描角質(zhì)層成分分析

取10 mL 的2.5%戊二醛固定液，加入采樣瓶中，用鑷子撕下一塊番茄表皮，用手術(shù)刀輕柔地將番茄表皮切成3 mm×5 mm 的長方形，迅速放入采樣瓶中，蓋緊橡膠瓶蓋，置于4 ℃冰箱中，24 h 后取出。將處理后的番茄果皮分別用不同濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇清洗20 min，再用100%的乙醇清洗5 次，每次20 min，以保證完全脫水。之后樣品干燥1.5 h 后，在解剖鏡下將樣品用黑色導(dǎo)電膠帶固定至電鏡掃描臺上，噴金，上機(jī)觀察角質(zhì)層。

1.4.8SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平的測定

番茄SlSHINE3基因提取采用高志民等[21]的方法。提取的番茄果實RNA，在檢測合格后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其余送至青島深泉檢測公司進(jìn)行二代測序分析。qRT-PCR 反應(yīng)采 用CFX96 Real-time PCR detection Systems，按 照SYBRPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒操作說明進(jìn)行。引物信息：SlASR1 RT-F CCTGTTCCACCACAAG GACAA、SlASR1RT-RGTGCCAAGTTTACCGATTTG、SlSH INE3RT-FATGCAAAGCTGAGGAAATGTTG、SlSHINE3RT-R GATGTTTTTTGCCACACTCCAA。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用Origin 2019 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行做圖，采用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濕度對番茄貯藏期內(nèi)失重率的影響

番茄失水對果蔬的外觀形態(tài)與內(nèi)在組織影響較大，不利于果蔬的貯藏[22]。圖1 顯示了不同濕度對番茄貯藏期內(nèi)失重率的影響。由圖可知，隨著貯藏時間的延長，貯藏在50%±5%及100%±5%貯藏濕度下的番茄的失重率都呈上升趨勢，且100%±5%貯藏濕度下的番茄失重率小于50%±5%，100%±5%貯藏濕度對番茄的保水效果較好，這可能是由于高貯藏濕度抑制了番茄表面的水分散失，從而延緩了番茄內(nèi)部水分的流失。這表明，100%±5%貯藏濕度可以減少番茄失重率，更有利于番茄的貯藏保鮮。

圖1 不同貯藏濕度對番茄失重率的影響Fig.1 Effect of different storage humidity on weight loss rate of tomato

2.2 不同濕度對番茄貯藏期內(nèi)SSC 含量的影響

由圖2 可知，在貯藏期內(nèi)，50%±5%和100%±5%貯藏濕度條件下的番茄SSC 含量均呈下降趨勢，且50%±5%貯藏濕度下番茄SSC 含量下降趨勢比100%±5%的更明顯。這表明，100%±5%貯藏濕度能夠減緩番茄SSC含量的降低。

圖2 不同貯藏濕度對番茄SSC 含量的影響Fig.2 Effect of different storage humidity on soluble solid content of tomato

2.3 不同濕度對番茄貯藏期內(nèi)PPO 活性的影響

由圖3 可知，隨著貯藏時間的延長，50%±5%貯藏濕度下番茄PPO 活性明顯上升，100%±5%貯藏濕度下番茄PPO 活性保持在較穩(wěn)定的水平，變動幅度較50%±5%的?。?00%±5%濕度處理下番茄中PPO 活性低于50%±5%貯藏濕度下的，可見100%±5%的濕度處理更能有效抑制番茄中PPO 活性，延緩番茄氧化衰老，抑制其氧化褐變。

圖3 不同貯藏濕度對番茄PPO 活性的影響Fig.3 Effect of different storage humidity on PPO activity of tomato

2.4 不同濕度對番茄貯藏期內(nèi)POD 活性的影響

由圖4 可知，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏濕度對番茄POD 活性產(chǎn)生不同影響，貯藏到18 d，50%±5%和100%±5%貯藏濕度下番茄POD 活性差異明顯（P＜0.05），說明不同貯藏濕度對番茄POD 產(chǎn)生影響。而在貯藏到16 d 時，不同貯藏濕度下，兩組POD 數(shù)據(jù)差異不顯著（P＞0.05）。不同濕度對番茄POD 影響需要后續(xù)深入研究。

圖4 不同貯藏濕度對番茄POD 活性的影響Fig.4 Effect of different storage humidity on POD activity of tomato

2.5 不同濕度對番茄貯藏期內(nèi)MDA 的影響

MDA 是植物組織膜過氧化的主要產(chǎn)物，其含量的多少反映膜損傷的程度[20]。由圖5 可知，隨著貯藏時間的延長，番茄MDA 含量明顯增加，在貯藏期內(nèi)，50%±5%貯藏濕度下番茄MDA 含量高于100%±5%貯藏濕度下的。這表明，100%±5%的貯藏濕度處理可以抑制其在貯藏期間MDA 的積累，從而抑制番茄組織過氧化反應(yīng)，延長番茄的貯藏期。

圖5 不同貯藏濕度對番茄MDA 的影響Fig.5 Effect of different storage humidity on MDA of tomato

2.6 不同濕度對番茄貯藏期間角質(zhì)層形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

角質(zhì)層在保持番茄果實的完整性及防止果實破裂變形等方面具有重要作用[23]。由圖6 可知，在貯藏第0 天時，番茄表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞成熟清晰且排列整齊緊湊；但隨著貯藏時間的延長，50%±5%貯藏濕度下的番茄角質(zhì)層結(jié)構(gòu)之間的間隙逐漸增大，個別細(xì)胞破裂，細(xì)胞形態(tài)不再完整；100%±5%貯藏濕度下的番茄角質(zhì)層結(jié)構(gòu)之間的間隙略有增加，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)依舊完整，無破損現(xiàn)象。這表明，100%±5%貯藏濕度下的番茄表皮形態(tài)更加完整，防御外界環(huán)境侵害的能力更強(qiáng)，更有利于番茄的貯藏保鮮。

圖6 不同濕度下番茄角質(zhì)層形態(tài)學(xué)觀察Fig.6 Morphological observation of tomato cuticle under different humidity

2.7 不同濕度對番茄貯藏期內(nèi)番茄表皮結(jié)構(gòu)的影響

如圖7 所示，貯藏第6 天，掃描電鏡下，貯藏在100%±5%濕度下和50%±5%濕度下的番茄外表皮外觀無明顯差別。但隨著貯藏時間的延長，貯藏到第18 天時，在100%±5%和50%±5%濕度下的番茄表皮趨于粗糙；而50%±5%濕度下的外表皮則更為粗糙。

圖7 不同濕度下番茄角質(zhì)層形態(tài)學(xué)觀察Fig.7 Morphological observation of tomato cuticle under different humidity

2.8 不同濕度對番茄貯藏期內(nèi)SlSHINE3 調(diào)控因子表達(dá)水平的影響

如圖8 所示，SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平隨著貯藏時間的延長整體呈下降趨勢，貯藏第3 天時，在100%±5%和50%±5%濕度下番茄的SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)量較低，且貯藏在50%±5%濕度表達(dá)下降更明顯，貯藏到第18 天時，貯藏在濕度100%±5%的SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平明顯高于貯藏50%的濕度,說明不同濕度對SlSHINE3因子表達(dá)產(chǎn)生影響，因SlSHINE3因子控制果實角質(zhì)層的合成，高濕度環(huán)境下，可更有利于穩(wěn)定保持果實表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，從而延長番茄貯藏周期。

圖8 不同貯藏濕度下番茄SlSHINE3 調(diào)控因子表達(dá)水平Fig.8 Expression level of SlSHINE3 regulatory factors in tomato under different storage humidity

3 結(jié)論

50%±5%貯藏濕度下番茄的可溶性固形物含量可以得到明顯的提升，但不適宜長期貯藏。而100%±5%貯藏濕度條件下的番茄可溶性固形物含量更加穩(wěn)定，失重率較小，延緩了SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平的下降，同時能夠更好地保持番茄的外觀和結(jié)構(gòu)形態(tài)，降低貯藏過程中MDA 含量及PPO 活性，延緩果實的軟化衰老?？傊?，該條件濕度不論是短期貯藏還是長期貯藏，都更有利于番茄果實貯藏品質(zhì)的保持。