曾義準(zhǔn)，張?zhí)?，徐?/p>

分析小鼠晝夜節(jié)律變化的行為學(xué)方法

曾義準(zhǔn)，張?zhí)?，徐?/p>

蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院，劍橋–蘇大基因組資源中心，蘇州 215123

晝夜節(jié)律是指生命活動(dòng)以24小時(shí)為周期的內(nèi)在性節(jié)律。為了適應(yīng)晝夜環(huán)境周期性的變化，地球上幾乎所有生物體，包括藻類、細(xì)菌、植物、動(dòng)物等，都演化出一個(gè)特殊的系統(tǒng)——生物鐘，用以指揮不同組織與器官來適應(yīng)環(huán)境的晝夜交替，維持機(jī)體的生理穩(wěn)態(tài)和行為與環(huán)境晝夜變化同步。生物鐘是指由內(nèi)源性分子時(shí)鐘控制的日周生理振蕩過程，人類生命活動(dòng)的各個(gè)層面，包括行為、生理、代謝等都受到生物鐘的調(diào)控，并表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律，如睡眠與蘇醒、警覺程度與運(yùn)動(dòng)能力、體溫波動(dòng)、泌尿系統(tǒng)、激素分泌、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞因子釋放等。晝夜節(jié)律紊亂可能影響各種疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后。因此在機(jī)體的發(fā)育、衰老及疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中評估晝夜節(jié)律是否異常具有重要的意義。結(jié)合本課題組相關(guān)研究，本文較為系統(tǒng)性地討論了幾種適用不同目的鑒別晝夜節(jié)律行為異常的方法，分享了具體的實(shí)驗(yàn)操作以及分析思路，包括利用代謝籠測量活動(dòng)節(jié)律、自由跑輪活動(dòng)監(jiān)測、倒時(shí)差、長光照、骨骼光周期以及T7-cycle，并解釋了不同行為學(xué)方法背后的生理意義。除此之外，本文還探究了不同遺傳背景以及不同來源小鼠的晝夜節(jié)律在適應(yīng)外界環(huán)境變化上的可能差異，為相關(guān)研究提供了可行的參考。根據(jù)這些原則及方法，以期幫助相關(guān)科研人員選擇合適的實(shí)驗(yàn)來評估遺傳因素、環(huán)境因素或疾病對晝夜節(jié)律行為的影響。

晝夜節(jié)律；代謝籠；跑輪；測量方法

為了適應(yīng)24小時(shí)晝夜變化的外界環(huán)境，地球上的生物進(jìn)化出了晝夜節(jié)律系統(tǒng)。機(jī)體的許多生理過程，如睡眠/覺醒、活動(dòng)、激素分泌等都表現(xiàn)出近24小時(shí)周期的節(jié)律[1,2]。晝夜節(jié)律系統(tǒng)幾乎參與了機(jī)體所有生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)[3]。晝夜節(jié)律紊亂會(huì)對健康造成重大影響，包括睡眠障礙、腫瘤發(fā)生、代謝紊亂、免疫系統(tǒng)疾病等。對輪班工人的研究表明，長期的輪班工作會(huì)影響機(jī)體的脂質(zhì)和碳水化合物的代謝，改變胰島素抵抗水平以及生長激素和皮質(zhì)類固醇分泌模式[4～6]。此外，流行病學(xué)研究顯示，一些疾病如高血壓、左心室肥大、冠心病和心機(jī)梗塞在輪班工作人群中發(fā)生更頻繁更嚴(yán)重[7～9]。而最近的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies, GWAS)也將睡眠障礙、心理健康和代謝紊亂等疾病的病因?qū)W與生物鐘聯(lián)系起來[10]。因此，晝夜節(jié)律與生理穩(wěn)態(tài)和疾病是密切相關(guān)的。

哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)受生物鐘調(diào)控，生物鐘是由核心生物鐘基因構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)。小鼠()體內(nèi)幾乎每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)都存在生物鐘，實(shí)現(xiàn)晝夜節(jié)律的調(diào)控。生物鐘基因缺失或突變能夠?qū)е滦∈笊镧姷奈蓙y，行為學(xué)上可以觀察到內(nèi)在節(jié)律喪失、周期偏離正常范圍[11～13]，而這些突變小鼠分別有睡眠、代謝、生殖、腫瘤等不同的表型，提示了生物鐘基因或生物節(jié)律的改變與疾病有密切的關(guān)聯(lián)。

由于光線是晝夜節(jié)律系統(tǒng)中最有力的授時(shí)因子，光照對晝夜節(jié)律系統(tǒng)的同步是普遍存在的現(xiàn)象[14]。對于小鼠來說，光照是影響晝夜節(jié)律變化的最重要環(huán)境因素，可以重置小鼠的晝夜節(jié)律，通過牽引作

用實(shí)現(xiàn)小鼠晝夜節(jié)律與外界環(huán)境同步[15]。在現(xiàn)實(shí)生活中，跨時(shí)區(qū)飛行、季節(jié)性日照時(shí)間的改變，都是外界光照對機(jī)體晝夜節(jié)律牽引的現(xiàn)象[16]。許多基因突變小鼠都表現(xiàn)出適應(yīng)外界光照變化能力的改變[17～19]。光線還可以直接對小鼠的活動(dòng)起到抑制作用(masking)。機(jī)體對光照的響應(yīng)很大程度上依賴晝夜節(jié)律系統(tǒng)，因此人們通?？梢岳貌煌墓庹罩芷?、光照時(shí)間點(diǎn)、光照強(qiáng)度來檢測小鼠晝夜節(jié)律系統(tǒng)對于光線的響應(yīng)，記錄小鼠的行為變化，進(jìn)而分析某些基因的缺陷是否對生物節(jié)律產(chǎn)生影響[20]。

本文以Slc7a11突變小鼠為例，使用不同的晝夜節(jié)律行為學(xué)檢測方法對小鼠進(jìn)行行為學(xué)表型檢測[21]，包括代謝籠、小鼠自由跑輪活動(dòng)監(jiān)測、倒時(shí)差反應(yīng)、長光照、骨骼光周期和T7-cycle等。本文對小鼠晝夜節(jié)律的行為學(xué)檢測方法進(jìn)行了較為全面的總結(jié)，提供了一套系統(tǒng)性、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法和分析思路，并闡述了這些行為學(xué)方法的生物學(xué)意義。這些實(shí)驗(yàn)方法可以作為晝夜節(jié)律表型分析的篩選流程。此外，文中還對晝夜節(jié)律檢測過程中可能遇到的問題、可能導(dǎo)致的原因包括遺傳背景及燈光強(qiáng)度等因素進(jìn)行了分析，強(qiáng)調(diào)了遺傳背景在此過程中發(fā)揮的作用，以期能有效幫助研究人員規(guī)避評估小鼠晝夜節(jié)律行為學(xué)檢測中可能遇到的問題。

1 材料與方法

1.1 小鼠飼養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)使用的Slc7a11突變小鼠來自于蘇州大學(xué)劍橋–蘇大基因組資源中心，C57BL/6J和C57BL/6N小鼠分別購買于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司、北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司和斯貝福(蘇州)生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)劍橋–蘇大基因組資源中心SPF級設(shè)施中，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22±2℃，環(huán)境濕度為60%～70%，小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)光照環(huán)境中(8:00開燈，20:00關(guān)燈)，并自由取得食物和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過蘇州大學(xué)劍橋–蘇大基因組資源中心動(dòng)物倫理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)通過(CAM-SU-AP#: YX- 2017-1)。

1.2 小鼠晝夜節(jié)律檢測方法

1.2.1 代謝籠檢測小鼠晝夜節(jié)律

代謝籠由檢測活動(dòng)、食物、水、氧氣含量和二氧化碳含量等檢測模塊和數(shù)據(jù)記錄、數(shù)據(jù)儲存等模塊組成的一套實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以連續(xù)實(shí)時(shí)記錄小鼠活動(dòng)、進(jìn)食、飲水、氧耗量和二氧化碳產(chǎn)生量[22]。本文以Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠為例，使用美國哥倫布公司搭建的代謝籠系統(tǒng)(Coulumbus Instruments, CLAMS)。用代謝籠檢測小鼠活動(dòng)和飲食晝夜節(jié)律過程的具體操作如下：將小鼠單獨(dú)放置于代謝籠的籠盒內(nèi)，前3 d為適應(yīng)階段，從第4 d開始記錄，第4 d至第6 d每隔20 min記錄小鼠活動(dòng)、飲食和飲水?dāng)?shù)據(jù)，連續(xù)記錄3 d (附圖1A)。適應(yīng)階段以及記錄階段小鼠所處環(huán)境皆為正常飼養(yǎng)環(huán)境，光照周期為標(biāo)準(zhǔn)光照周期(8:00開燈，20:00關(guān)燈)。

1.2.2 跑輪檢測小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期

小鼠跑輪活動(dòng)由生物節(jié)律監(jiān)測系統(tǒng)記錄，該系統(tǒng)購置于武漢一鳴智能科技有限公司。與代謝籠相比，跑輪記錄是檢測小鼠活動(dòng)晝夜節(jié)律的經(jīng)典設(shè)備，可以長期檢測小鼠活動(dòng)的節(jié)律，被廣泛運(yùn)用于異常小鼠晝夜節(jié)律的篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列晝夜節(jié)律異常的突變體[23]。實(shí)驗(yàn)過程中，將小鼠單獨(dú)放置于帶有滾輪的籠盒中(蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)，在籠盒中小鼠自由獲得食物和飲水?；\盒與記錄倉相連，每個(gè)記錄倉可以單獨(dú)調(diào)節(jié)光照周期以及光照強(qiáng)度。小鼠在滾輪上每跑動(dòng)一圈，記錄倉便記錄一次數(shù)據(jù)(附圖1B)。

跑輪檢測小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期的具體操作過程如下：將小鼠單獨(dú)放置于帶有滾輪的籠盒中并置于記錄倉中與記錄系統(tǒng)連接。小鼠在標(biāo)準(zhǔn)光照環(huán)境中(8:00開燈，20:00關(guān)燈)牽引7～10 d，使得每一只小鼠的晝夜節(jié)律被外界光照穩(wěn)定牽引。接下來關(guān)閉燈光，環(huán)境燈光變?yōu)槌掷m(xù)黑暗，并至少記錄14 d (圖1A)。因?yàn)橥饨绛h(huán)境恒定，不存在影響小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律的外界因素，所以持續(xù)黑暗中小鼠跑輪結(jié)果反映了小鼠內(nèi)在的節(jié)律(free running)。隨后根據(jù)跑輪記錄到的小鼠在持續(xù)黑暗下活動(dòng)可以計(jì)算得到小鼠的內(nèi)在節(jié)律周期。周期可以根據(jù)在持續(xù)黑暗中小鼠跑輪活動(dòng)的斜率計(jì)算得到(圖1B，紅線)，公式如下：

1.2.3 倒時(shí)差實(shí)驗(yàn)

為檢測小鼠適應(yīng)外界環(huán)境晝夜變化的能力，通常使用倒時(shí)差實(shí)驗(yàn)來檢測小鼠被重新牽引的能力。倒時(shí)差實(shí)驗(yàn)具體操作步驟為：將小鼠單獨(dú)放置于帶有滾輪的籠盒中并置于記錄倉中與記錄系統(tǒng)連接，首先小鼠被置于標(biāo)準(zhǔn)光照環(huán)境中(8:00開燈，20:00關(guān)燈) 7～10 d，使得小鼠晝夜節(jié)律被穩(wěn)定牽引；隨后將開燈時(shí)間周期前移，如：2:00開燈，14:00關(guān)燈，模擬向東跨6個(gè)時(shí)區(qū)飛行。小鼠倒時(shí)差后馴化天數(shù)是視小鼠適應(yīng)時(shí)差的天數(shù)而定(在完全適應(yīng)新燈光后再馴化固定天數(shù))。在小鼠跑輪活動(dòng)被穩(wěn)定牽引后，再將開燈時(shí)間后移，如：8:00開燈，20:00關(guān)燈，模擬向西跨6個(gè)時(shí)區(qū)飛行[24]。分別測量小鼠在2次倒時(shí)差過程中的起跳點(diǎn)時(shí)間的變化，來說明小鼠適應(yīng)新時(shí)區(qū)的快慢，反應(yīng)小鼠被再次牽引的能力(圖1C)。隨后根據(jù)小鼠完全適應(yīng)新時(shí)區(qū)所需要的天數(shù)來反應(yīng)適應(yīng)環(huán)境變化的能力。

圖1 小鼠晝夜節(jié)律檢測方法光照方案示意圖

A：跑輪檢測小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期。圖中陰影部分對應(yīng)的是關(guān)燈時(shí)間段，圖中白色部分對應(yīng)的是開燈時(shí)間段。B：小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期計(jì)算方法示意圖。紅線表示小鼠跑輪起跳點(diǎn)的連線，綠線表示活動(dòng)起跳點(diǎn)遷移的時(shí)間，藍(lán)線表示持續(xù)黑暗中的天數(shù)。C：小鼠倒時(shí)差實(shí)驗(yàn)光照方案示意圖。D：小鼠長光照實(shí)驗(yàn)光照方案示意圖。E：小鼠骨骼光周期實(shí)驗(yàn)光照方案示意圖。圖中黃色部分表示15 min的光脈沖。F：小鼠T7-cycle實(shí)驗(yàn)光照方案示意圖。圖中黃色部分表示3.5 h光照。

1.2.4 長光照與短光照實(shí)驗(yàn)

倒時(shí)差實(shí)驗(yàn)?zāi)M了跨越不同時(shí)區(qū)(經(jīng)度)飛行，機(jī)體重新適應(yīng)新的時(shí)區(qū)的過程。在同一地區(qū)，由于不同季節(jié)的日照情況不同，機(jī)體會(huì)利用晝夜節(jié)律系統(tǒng)來適應(yīng)季節(jié)性光照的變化。在我國大部分地區(qū)，夏季日照時(shí)間長，冬季日照時(shí)間短，而夏至和冬至分別對應(yīng)日照時(shí)間極長和極短的時(shí)間。

研究人員通常使用長光照或者短光照來反應(yīng)小鼠適應(yīng)季節(jié)性日長變化的能力。在實(shí)驗(yàn)中，小鼠被置于標(biāo)準(zhǔn)光照環(huán)境中(8:00開燈，20:00關(guān)燈) 7～10 d，使得小鼠晝夜節(jié)律被穩(wěn)定牽引。然后，將光照時(shí)長改變，如：光照時(shí)間改為18 h，黑暗時(shí)間為6 h (5:00開燈，23:00關(guān)燈)，在小鼠跑輪活動(dòng)被穩(wěn)定牽引后，再恢復(fù)到標(biāo)準(zhǔn)光照環(huán)境(8:00開燈，20:00關(guān)燈)中(圖1D)[25]。此外，還可以通過調(diào)節(jié)開關(guān)燈時(shí)間來縮短光照時(shí)間，探究小鼠適應(yīng)短光照的能力。隨后根據(jù)小鼠在長光照或者短光照下的活動(dòng)時(shí)長來反映小鼠適應(yīng)季節(jié)性日長變化的能力。

1.2.5 骨骼光周期實(shí)驗(yàn)

機(jī)體適應(yīng)新的時(shí)區(qū)和長短光照，都是機(jī)體被外界光照牽引的過程。外界光照對小鼠的活動(dòng)主要有牽引和抑制活動(dòng)的作用。牽引作用是通過外界光照重置生物鐘，影響小鼠活動(dòng)的相位。光照抑制活動(dòng)指的是光照可以直接抑制小鼠的活動(dòng)量，即在小鼠活動(dòng)時(shí)施加光照，小鼠的活動(dòng)量會(huì)顯著降低。因此，當(dāng)小鼠在標(biāo)準(zhǔn)光照下活動(dòng)相位出現(xiàn)異常時(shí)，可能是小鼠被外界光照牽引的能力異常，也有可能是小鼠活動(dòng)被外界光照抑制的能力出現(xiàn)異常。

骨骼光周期實(shí)驗(yàn)就是用來檢測外界光照對小鼠活動(dòng)的牽引能力。在實(shí)驗(yàn)中，小鼠首先被置于標(biāo)準(zhǔn)光照環(huán)境(8:00開燈，20:00關(guān)燈)中7～10 d，使得小鼠晝夜節(jié)律被穩(wěn)定牽引。然后，將光照條件調(diào)為持續(xù)黑暗，只在標(biāo)準(zhǔn)光照對應(yīng)的開燈和關(guān)燈時(shí)間點(diǎn)給與很短的光照脈沖，最大程度地減少在實(shí)驗(yàn)過程中光照對小鼠活動(dòng)的抑制作用，光照周期應(yīng)該盡量接近小鼠內(nèi)在節(jié)律的周期，如：8:00～8:15和19:45～20:00開燈，光照周期為24 h，其余時(shí)間保持黑暗(圖1E)[26]。根據(jù)穩(wěn)定牽引的定義，首先計(jì)算小鼠在骨骼光下的活動(dòng)周期，是否和外界光照周期一致。然后，判斷每個(gè)周期內(nèi)小鼠活動(dòng)的相位和光照的時(shí)間點(diǎn)關(guān)系是否穩(wěn)定。根據(jù)這兩個(gè)條件判斷小鼠是否可以被外界光照穩(wěn)定牽引。在穩(wěn)定牽引的基礎(chǔ)上再比較實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠活動(dòng)的相位，如活動(dòng)起跳點(diǎn)，說明兩種小鼠活動(dòng)相位的差異。

1.2.6 T7-cycle實(shí)驗(yàn)

光照除了可以重置小鼠活動(dòng)的相位，實(shí)現(xiàn)對小鼠活動(dòng)晝夜節(jié)律的牽引，還可以直接抑制小鼠的活動(dòng)，減少小鼠的活動(dòng)量。因此，在檢測光照對小鼠活動(dòng)量的抑制能力時(shí)，要盡可能排除光照的牽引作用。

T7-cycle是檢測光照對小鼠活動(dòng)抑制的常用方法。在實(shí)驗(yàn)中，光照條件設(shè)置為3.5 h開燈，3.5 h關(guān)燈，以此循環(huán)往復(fù)。此過程中，光照周期是7 h，與小鼠晝夜節(jié)律周期差距較大，且非24 h的約數(shù)，所以小鼠的晝夜節(jié)律不能被7 h光照周期牽引，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最大程度上反應(yīng)了光照直接對小鼠活動(dòng)抑制作用(圖1F)[27]。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠被置于T7-cycle光照條件下至少7 d，因?yàn)樵? d的實(shí)驗(yàn)過程中各個(gè)7 h的時(shí)間窗口都會(huì)經(jīng)歷3.5 h光照～3.5 h黑暗的光照變化。隨后通過統(tǒng)計(jì)小鼠的活動(dòng)量來評價(jià)光照對小鼠活動(dòng)的抑制作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

小鼠代謝籠數(shù)據(jù)的活動(dòng)起跳點(diǎn)由同步篩選器識別[22]。小鼠跑輪活動(dòng)起跳點(diǎn)由Clock lab軟件識別。數(shù)據(jù)差異使用GraphPad軟件(v6)的雙側(cè)Student’s檢測。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中，<0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝籠初篩生物節(jié)律行為異常

當(dāng)晝夜節(jié)律出現(xiàn)缺陷的時(shí)候，小鼠的活動(dòng)和飲食規(guī)律有可能出現(xiàn)晝夜紊亂，而代謝籠具有實(shí)時(shí)記錄活動(dòng)及攝食的功能。本文以Slc7a11突變小鼠為例說明代謝籠對小鼠節(jié)律的檢測(材料與方法1.2.1)。根據(jù)數(shù)據(jù)分析可以看到，第1 d和第3 dSlc7a11突變小鼠表現(xiàn)出活動(dòng)起跳點(diǎn)提前的表型(圖2A)。盡管在代謝籠中第2 d，Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠的活動(dòng)起跳點(diǎn)沒有明顯差異，但在關(guān)燈時(shí)刻前后Slc7a11突變小鼠的活動(dòng)比同窩野生型小鼠提前下降(圖2A，紅色箭頭)。接下來，使用同步篩選器識別小鼠活動(dòng)的起跳點(diǎn)時(shí)間和峰值相位，發(fā)現(xiàn)第1 d和第3 d時(shí)Slc7a11突變小鼠的起跳點(diǎn)時(shí)間提前(圖2B)，第3 d時(shí)Slc7a11突變小鼠的峰值相位提前(圖2C)。代謝籠不僅可以記錄小鼠的活動(dòng)還可以記錄小鼠的進(jìn)食，通過對Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠的進(jìn)食量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠的進(jìn)食節(jié)律模式?jīng)]有明顯差異，都是夜晚進(jìn)食明顯高于白天，只是在部分時(shí)間點(diǎn)Slc7a11突變小鼠進(jìn)食量高于同窩野生型小鼠(圖2D)。

2.2 利用跑輪檢測小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期

小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律的周期是最容易檢測的節(jié)律參數(shù)，此處以Slc7a11突變小鼠為例，說明小鼠的內(nèi)在晝夜節(jié)律周期測量實(shí)驗(yàn)(材料與方法1.2.2)。在持續(xù)黑暗中野生型和突變小鼠都表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律(圖3，A和B)，通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠的內(nèi)在晝夜節(jié)律周期沒有明顯差異(圖3C)。這個(gè)結(jié)果說明野生型和Slc7a11突變小鼠內(nèi)在節(jié)律的快慢沒有明顯的差異。

2.3 利用跑輪測量小鼠對時(shí)差的響應(yīng)

小鼠倒時(shí)差是檢測小鼠適應(yīng)外界光照變化的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。本文以Slc7a11突變小鼠兩次倒時(shí)差實(shí)驗(yàn)為例，介紹倒時(shí)差實(shí)驗(yàn)的過程(材料與方法1.2.3)。在向東(提前) 6 h倒時(shí)差的過程中野生型小鼠逐漸適應(yīng)新的時(shí)區(qū)(圖4A)，而Slc7a11突變小鼠出現(xiàn)一天就被牽引到新時(shí)區(qū)的現(xiàn)象(圖4B)。向西(延遲) 6 h倒時(shí)差的過程中，野生型小鼠和Slc7a11突變小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的差異(圖4，A和B)。在向東調(diào)時(shí)差過程中，Slc7a11突變小鼠活動(dòng)起跳點(diǎn)在前4 d明顯早于野生型，能更早適應(yīng)新時(shí)區(qū)，而向西調(diào)時(shí)差過程中小鼠活動(dòng)起跳點(diǎn)沒有差異(圖4C)。

圖2 代謝籠檢測Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠活動(dòng)變化

A：Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠在12 h光照/12 h黑暗光照條件下代謝籠監(jiān)測的活動(dòng)情況。Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各10只小鼠，結(jié)果用Mean±SEM表示。ZT：給時(shí)者時(shí)間(zeitgeber time)；標(biāo)準(zhǔn)光照下ZT 0表示開燈時(shí)間點(diǎn)，ZT 12表示關(guān)燈時(shí)間點(diǎn)，ZT6指的是開燈后6 h，ZT18指的是關(guān)燈后6 h，以此類推。B：小鼠活動(dòng)的起跳點(diǎn)時(shí)間統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果用Mean±SEM表示。C：小鼠活動(dòng)的峰值相位時(shí)間。結(jié)果用Mean±SEM表示。D：Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠在12 h光照/12 h黑暗條件下代謝籠監(jiān)測的進(jìn)食情況。結(jié)果用Mean±SEM表示。Slc7a11突變小鼠的活動(dòng)、起跳點(diǎn)時(shí)間、峰值相位和進(jìn)食量利用雙側(cè)Student’s檢測；*<0.05，**<0.01，n.s.表示>0.05。圖B、C數(shù)據(jù)來源本實(shí)驗(yàn)室先前的研究[21]。

圖3 Slc7a11tm1a/tm1a跑輪活動(dòng)晝夜節(jié)律周期

A：野生型小鼠跑輪圖。B：Slc7a11突變小鼠跑輪圖。Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各8只，圖中陰影部分對應(yīng)的是關(guān)燈時(shí)間段，白色部分對應(yīng)的是開燈時(shí)間段。C：野生型小鼠(藍(lán)色)和Slc7a11突變小鼠(紅色)跑輪活動(dòng)的晝夜節(jié)律周期。結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，n.s.表示>0.05。

圖4 Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠對6 h相位前移和后移的響應(yīng)

A：野生型小鼠6 h提前和延遲時(shí)差的跑輪圖。圖中紅色線段表示活動(dòng)起跳點(diǎn)。B：Slc7a11突變小鼠6 h提前和延遲時(shí)差的跑輪圖。在第22 d小鼠跑輪距離中斷了24 h，圖中紅色線段表示活動(dòng)起跳點(diǎn)。C：野生型小鼠(藍(lán)色，同窩野生型小鼠9只)和Slc7a11突變小鼠(紅色，Slc7a11突變小鼠5只)適應(yīng)6 h提前和延遲時(shí)差的活動(dòng)起跳點(diǎn)變化曲線。圖中陰影部分對應(yīng)的是關(guān)燈時(shí)間段，白色部分對應(yīng)的是開燈時(shí)間段，結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，*<0.05。

2.4 利用長光照模擬季節(jié)適應(yīng)

除了所在時(shí)區(qū)的變化，季節(jié)性日照時(shí)間長度的改變，也是一種常見的外界光照環(huán)境的變化。本文以Slc7a11突變小鼠適應(yīng)長光照實(shí)驗(yàn)為例，介紹適應(yīng)長光照的過程(材料與方法1.2.4)。在12 h光照條件下，小鼠活動(dòng)集中在關(guān)燈時(shí)間段，轉(zhuǎn)變?yōu)?8 h光照時(shí)，小鼠的活動(dòng)區(qū)間被壓縮到約6 h，但小鼠活動(dòng)仍然集中在關(guān)燈時(shí)間段(圖5，A和B)。Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠在適應(yīng)長光照和恢復(fù)正常12 h光照的過程中，活動(dòng)起跳點(diǎn)時(shí)間的變化情況一致，沒有明顯差異(圖5C)。

2.5 利用骨骼光周期檢測小鼠對光照牽引的響應(yīng)

外界光照可以牽引小鼠的活動(dòng)相位，又可以直接抑制小鼠的活動(dòng)。通常使用骨骼光周期實(shí)驗(yàn)檢測光照對小鼠活動(dòng)的牽引能力。本文以Slc7a11突變小鼠對骨骼光照的響應(yīng)為例，介紹該實(shí)驗(yàn)過程(材料與方法1.2.5)。在骨骼光照條件下，Slc7a11突變小鼠活動(dòng)提前于光照脈沖，野生型小鼠在給予光照脈沖時(shí)開始活動(dòng)，但是兩種小鼠都保持著強(qiáng)健的節(jié)律(圖6，A和B)，并且骨骼光周期下兩種小鼠活動(dòng)的周期仍然維持在24 h左右(圖6C)。統(tǒng)計(jì)活動(dòng)起跳點(diǎn)時(shí)間發(fā)現(xiàn)，Slc7a11突變小鼠活動(dòng)起跳點(diǎn)明顯早于野生型小鼠(圖6D)。這說明光照脈沖可以牽引兩種小鼠的活動(dòng)，但是骨骼光周期對Slc7a11突變小鼠牽引時(shí)的相位角與野生型不同，暗示在小鼠晝夜節(jié)律于外界環(huán)境的同步化過程中發(fā)揮作用。

2.6 利用T7-cycle檢測光照對小鼠活動(dòng)的抑制作用

T7-cycle可以檢測光照直接對小鼠活動(dòng)的抑制作用。本文以Slc7a11突變小鼠在T7-cycle及3.5 h光照/3.5 h黑暗下的活動(dòng)為例，介紹該實(shí)驗(yàn)過程(材料與方法1.2.6)。在T7-cycle條件下小鼠活動(dòng)保持近24 h的活動(dòng)周期(圖7，A和B，紅線區(qū)域)，并非跟隨光照而變動(dòng)。在小鼠活動(dòng)時(shí)間段內(nèi)，光照有效地抑制了小鼠活動(dòng)(圖7，A和B)。通過統(tǒng)計(jì)小鼠光照和黑暗期間小鼠活動(dòng)量之比，說明光照對小鼠活動(dòng)的抑制能力。定量結(jié)果顯示，Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠的活動(dòng)量被光照抑制的程度相同，沒有明顯差異(圖7C)。

圖5 Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠長光照的適應(yīng)

A：野生型小鼠適應(yīng)18 h光照跑輪圖。B：Slc7a11突變小鼠適應(yīng)18 h光照跑輪圖。A和B小圖中紅色線段表示活動(dòng)起跳點(diǎn)，Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各7只。C：野生型小鼠(藍(lán)色)和Slc7a11突變小鼠(紅色)適應(yīng)18 h光照的活動(dòng)起跳點(diǎn)變化曲線。圖中陰影部分對應(yīng)的是關(guān)燈時(shí)間段，白色部分對應(yīng)的是開燈時(shí)間段，結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，n.s.：>0.05。

圖6 Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠在骨骼光周期下的跑輪活動(dòng)

A：野生型小鼠在骨骼光周期下的跑輪圖。同窩野生型小鼠6只。B：Slc7a11突變小鼠在骨骼光周期下的跑輪圖。Slc7a11突變小鼠6只，圖中紅色線段表示活動(dòng)起跳點(diǎn)，黃色線段表示15 min的光照脈沖。C：Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠骨骼光周期下的周期統(tǒng)計(jì)。Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各5只，結(jié)果用Mean±SEM表示，n.s.:>0.05。D：野生型小鼠(藍(lán)色)和Slc7a11突變小鼠(紅色)骨骼光周期下活動(dòng)起跳點(diǎn)變化曲線。結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測。

圖7 Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠T7-cycle下的跑輪活動(dòng)

A：野生型小鼠在T7-cycle下的跑輪圖。B：Slc7a11突變小鼠在T7-cycle下的跑輪圖。A和B小圖中紅色線段內(nèi)區(qū)間表示活動(dòng)區(qū)域。Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各7只。C：野生型小鼠(藍(lán)色)和Slc7a11突變小鼠(紅色)光照時(shí)間段和黑暗時(shí)間段之間活動(dòng)量的比值。結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，n.s.表示>0.05。

2.7 小鼠遺傳背景對倒時(shí)差的影響

小鼠的遺傳背景對小鼠的許多表型有影響，即使相同的C57BL/6分出的亞系C57BL/6J與C57BL/6N在一些表型上也存在差異。那么6J和6N這兩個(gè)常見亞系之間是否會(huì)在生物鐘表型上出現(xiàn)差異呢？為了回答這個(gè)問題，本研究首先在200 lux條件下，檢測了來自不同供應(yīng)商(江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司、北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司、斯貝福(蘇州)生物技術(shù)有限公司)的C57BL/6J或C57BL/6N小鼠對8 h時(shí)差的響應(yīng)。通常8 h的時(shí)差反應(yīng)，需要一周時(shí)間適應(yīng)新的光照周期，如果迅速適應(yīng)，會(huì)被認(rèn)為生物鐘的魯棒性出現(xiàn)了問題。在比較各亞系及來自不同廠家的小鼠后發(fā)現(xiàn)，集萃藥康C57BL/6J小鼠在一周內(nèi)逐漸適應(yīng)8 h時(shí)差(圖8A)，其余小鼠都在第1 d就適應(yīng)了新的光照環(huán)境(圖8，B～E，附圖2)。所以在進(jìn)行時(shí)差反應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要非常關(guān)注小鼠的來源。此外，晝夜節(jié)律對外界信號的響應(yīng)程度也取決于外界信號的高低和內(nèi)在晝夜節(jié)律的強(qiáng)弱，由兩者相對大小決定。于是，將光照強(qiáng)度降低至20 lux，再檢測集萃藥康和維通利華來源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠對6 h時(shí)差的響應(yīng)。C57BL/6J和C57BL/6N都沒有在1 d內(nèi)完全適應(yīng)時(shí)差，集萃藥康來源的C57BL/6J和C57BL/6N是在一周左右適應(yīng)6 h的時(shí)差，而維通利華來源的小鼠大部分是在1～2 d時(shí)間適應(yīng)6 h時(shí)差(圖8，F(xiàn)～I(xiàn)，附圖3)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)小鼠在適應(yīng)時(shí)差過程中的起跳點(diǎn)時(shí)間的變化，發(fā)現(xiàn)200 lux條件下集萃藥康的C57BL/6J小鼠逐漸提前，小鼠的起跳點(diǎn)時(shí)間在1 d內(nèi)提前了8 h，且同一來源的相同遺傳背景的小鼠調(diào)時(shí)差過程中個(gè)體差異較大(圖8J)。在20 lux條件下，維通利華來源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠的起跳點(diǎn)時(shí)間在3 d時(shí)間提前了6 h時(shí)差，而集萃藥康來源的小鼠需要6～7 d以適應(yīng)新的光照方案，每一組內(nèi)的波動(dòng)仍然很大(圖8K)。為了更加直觀地解讀小鼠適應(yīng)時(shí)差的差異，本文進(jìn)一步計(jì)算了小鼠響應(yīng)時(shí)差過程中的PS50 (適應(yīng)一半時(shí)差所需要的時(shí)間)。在200 lux條件下，集萃藥康來源的C57BL/6J小鼠的PS50明顯大于其他小鼠，其他小鼠的PS50之間沒有差異(圖8L)。集萃藥康來源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠PS50明顯大于維通利華來源的小鼠，而同一供應(yīng)商C57BL/6J和C57BL/6N小鼠之間沒有明顯的差異(圖8L)。PS50的差異情況和小鼠適應(yīng)時(shí)差的過程，以及調(diào)時(shí)差過程中活動(dòng)起跳點(diǎn)時(shí)間的變化趨勢一致這些結(jié)果說明，不同遺傳背景的小鼠及不同廠商的小鼠適應(yīng)時(shí)差的能力不同。因此在選擇時(shí)差反應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要嚴(yán)格控制遺傳背景，不能使用不同來源廠商供應(yīng)的小鼠之間進(jìn)行比較。

圖8 不同遺傳背景小鼠對時(shí)差的響應(yīng)

A～I(xiàn)：不同遺傳背景小鼠時(shí)差的跑輪圖。GP：集萃藥康；CR：維通利華；SPF：斯貝福。J：200 lux光強(qiáng)下適應(yīng)8 h提前時(shí)差的活動(dòng)起跳點(diǎn)變化曲線。圖中陰影部分對應(yīng)關(guān)燈時(shí)間段，白色部分對應(yīng)開燈時(shí)間段，結(jié)果用Mean±SEM表示，各組小鼠都是6只。K: 20 lux光強(qiáng)下適應(yīng)6 h提前時(shí)差的活動(dòng)起跳點(diǎn)變化曲線。圖中陰影部分對應(yīng)關(guān)燈時(shí)間段，白色部分對應(yīng)開燈時(shí)間段，結(jié)果用Mean±SEM表示，各組小鼠都是6只。L:小鼠適應(yīng)時(shí)差過程中PS50的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。不同遺傳背景的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，*：<0.05，***<0.001。

3 討論

生物鐘領(lǐng)域所研究的科學(xué)問題一直以來都是生命科學(xué)的熱點(diǎn)方向，在2005年發(fā)布了125個(gè)人類最關(guān)注的科學(xué)問題，其中就包括機(jī)體生物鐘是如何同步化的[28]。另一方面，晝夜節(jié)律作為一個(gè)普遍的生物現(xiàn)象，生物體的許多過程都受到晝夜節(jié)律的調(diào)控并表現(xiàn)出晝夜振蕩[29,30]。機(jī)體晝夜節(jié)律的破壞，會(huì)影響疾病的發(fā)生、治療以及預(yù)后[31,32]。因此，尋找調(diào)控晝夜節(jié)律與外界環(huán)境同步化的關(guān)鍵基因，定義晝夜節(jié)律失同步與疾病間的關(guān)聯(lián)，已成為目前生物鐘領(lǐng)域亟需解答的熱點(diǎn)方向。本文以Slc7a11突變小鼠為例，設(shè)計(jì)了一整套評價(jià)晝夜節(jié)律的行為學(xué)方法，著重討論了光線對生物鐘的影響，目的在于為生物節(jié)律相關(guān)研究提供可參考的思路和可參借的研究方法。

早在2005年，Corinne等[33]發(fā)表了關(guān)于小鼠跑輪以及節(jié)律相關(guān)行為學(xué)研究的指南，該指南主要圍繞不同光照條件下的小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。本文不僅介紹了晝夜節(jié)律行為學(xué)檢測方法在實(shí)際科學(xué)研究中的應(yīng)用，同時(shí)提供了一套分析節(jié)律相關(guān)參數(shù)的方法并解釋了其生理意義，對檢測小鼠晝夜節(jié)律相關(guān)研究進(jìn)行了一個(gè)較為全面的整理和總結(jié)，期望為研究人員在進(jìn)行節(jié)律行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)提供幫助。此外，本文還進(jìn)一步探究了小鼠品系、遺傳背景以及光照強(qiáng)度對生物節(jié)律的可能影響，指出不同遺傳背景或不同廠商之間小鼠的晝夜節(jié)律對外界環(huán)境響應(yīng)都有可能帶來很大的差異，能夠有效幫助研究人員規(guī)避評估小鼠晝夜節(jié)律行為學(xué)檢測中可能遇到的問題，并分析一些可能的原因，如C57BL/6N是突變，為視網(wǎng)膜變性8突變的純合子，可能影響視網(wǎng)膜感光靈敏度，而C57BL/6J無該突變，因此可能造成光照牽引的差異。此外，飲食等因素也有可能影響晝夜節(jié)律的魯棒性[34]。因此在評價(jià)晝夜節(jié)律異常研究時(shí)，需要注意這些要點(diǎn)，以免帶來假陽性或忽略表型。

附錄：

附加材料見文章電子版www.chinagene.cn。

附圖1 代謝籠和跑輪系統(tǒng)裝置圖

Supplementary Fig. 1 Installation drawing of metabolism cage and wheel-running system

A：小鼠代謝籠裝置圖。1：小鼠進(jìn)食檢測裝置；2：小鼠飲水檢測裝置；3：紅外感應(yīng)檢測小鼠活動(dòng)情況裝置；4：小鼠消耗氧氣以及產(chǎn)生二氧化碳檢測裝置；5：在使用代謝籠記錄之前，首先對代謝籠進(jìn)行氣體平衡；6、7：將記錄的小鼠進(jìn)食、飲水情況傳遞給計(jì)算機(jī)；8：整合小鼠活動(dòng)代謝數(shù)據(jù)傳遞至計(jì)算機(jī)。B：小鼠跑輪裝置圖。1：光控開關(guān)，可以設(shè)置不同的開關(guān)燈時(shí)間，光照周期；2：光照強(qiáng)度調(diào)節(jié)開關(guān)，每一個(gè)記錄倉的燈光對應(yīng)一個(gè)光強(qiáng)開關(guān)；3：機(jī)械打點(diǎn)感應(yīng)器，連接在帶有跑輪的籠盒上，實(shí)時(shí)記錄滾輪的轉(zhuǎn)動(dòng)；4：記錄倉，每只小鼠單獨(dú)放置于記錄倉中，保證小鼠之間不會(huì)互相干擾；5：帶有滾輪的籠盒；6：數(shù)據(jù)集中處理裝置，同一排的七個(gè)打點(diǎn)器共同連接于此，并將數(shù)據(jù)傳遞給采集盒；7：數(shù)據(jù)采集盒，可以同時(shí)整合多通道的跑輪數(shù)據(jù)，并傳遞給計(jì)算機(jī)；8、9：Clocklab軟件，可以實(shí)時(shí)查看各個(gè)記錄通道的小鼠活動(dòng)情況；10：MATLAB軟件，一般通過局域網(wǎng)將動(dòng)物房Clocklab軟件記錄的數(shù)據(jù)共享至實(shí)驗(yàn)室，通過該軟件可以實(shí)時(shí)查看小鼠的活動(dòng)情況，以及計(jì)算小鼠的活動(dòng)周期、起跳點(diǎn)等參數(shù)。

附圖2 200 lux下不同遺傳背景小鼠倒時(shí)差跑輪圖

Supplementary Fig. 2 Wheel-running of mice with different genetic background to jet lag at 200 lux

附圖3 20 lux下不同遺傳背景小鼠倒時(shí)差跑輪圖

Supplementary Fig. 3 Wheel-running of mice with different genetic background to jet lag at 20 lux

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Rapid assessment of circadian behavior in mice

Yizhun Zeng, Tao Zhang, Ying Xu

Circadian rhythms have a cycle length of about 24 hours, i.e. a 24-hour internal clock. In order to adapt to the periodic changes of the circadian environment, almost all organisms on the earth, including algae, bacteria, plants, animals, etc., have evolved a special system—the circadian clock. It helps organisms to adapt to the daily changes in the environment and maintains the physiological process and the behavior in synchronization with the environment changes. Circadian rhythms are composed of an intracellular feedback loop that drives the expression of molecular components and their constitutive protein products to oscillate over a period of about 24 hours. Almost every aspect of the body's functions, including behavior and physiology, is regulated by the circadian clock, and shows obvious daily rhythms, such as sleep and wakefulness, alertness, body temperature fluctuations, urinary system, hormone secretion, immune regulation, and cytokine release. Circadian factors are also increasingly recognized for potentially affecting the occurrence, progression, treatment, and prognosis of a variety of diseases. This paper discusses several methods for measuring circadian behavior disorders in mice for different purposes, and shares experimental operations and analysis ideas, including the use of metabolism cage, wheel running activity, jet lag, lengthened light, bones photoperiod, as well as the T7-cycle. In addition, this paper also studies the possible reasons for variations caused by genetic backgrounds and light conditions. Given these methods, researchers can choose appropriate experiments to evaluate the influence of genetic factors, environmental factors or diseases on circadian behavior.

circadian rhythm;metabolism cage; wheel running; measuring method

2022-02-23;

2022-03-30;

2022-04-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31630091，32100931)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31630091, 32100931)]

曾義準(zhǔn)，本科，專業(yè)方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail: 20194250014@stu.suda.edu.cn

徐瓔，博士，教授，研究方向：生物鐘。E-mail: yingxu@suda.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-051

(責(zé)任編委: 陳帥)