楊 璐，劉 洋，王云霞，李 哲，熊亦雯，胡繼君，管一春，孫麗君

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，鄭州 450000)

過去十年，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)中冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer，F(xiàn)ET)的使用不斷上升。有報告顯示，2006至2012年，F(xiàn)ET周期數(shù)量增加了82.5%，超過了新鮮胚胎移植(fresh embryo transfer，ET)周期的增長速度[1]。大量研究表明，與傳統(tǒng)的ET相比，F(xiàn)ET可能會產(chǎn)生更好的新生兒結(jié)局，嬰兒低出生體重(low birth weight，LBW)發(fā)生率和早產(chǎn)(preterm birth，PTB)的風(fēng)險更低[2-3]。有研究認(rèn)為，這是由于FET周期具有更自然的子宮環(huán)境，有助于早期胎盤的正常植入，而ET周期中的卵巢刺激引起的高雌激素環(huán)境可能改變子宮內(nèi)膜血管生成和隨后的胎盤植入[4-5]。胎盤介于胎兒與母體之間，是維持胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育的重要器官。在胎盤的發(fā)育過程中，子宮內(nèi)膜的蛻膜化、滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附與侵襲、胎盤印跡基因的表達(dá)和胎盤血管的形成都受到表觀遺傳修飾的調(diào)控[6]。有關(guān)動物研究表明，胎盤組織比胚胎組織更易受到印跡基因表觀遺傳的干擾，這可能導(dǎo)致胎盤發(fā)育和功能的異常以及胎兒發(fā)育的異常[7]。PEGl0是哺乳動物進(jìn)化中起源較早的印跡基因之一，是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子來源的父源性表達(dá)印跡基因[8]。PEGl0位于7q21染色體，在胎盤、腦、腎、肝、卵巢、睪丸等組織中均有表達(dá)，與胎兒生長發(fā)育及胎盤形成植入密切相關(guān)[9]。L3MBTLl是位于20q13.12上的父系表達(dá)基因，在胎盤、造血干細(xì)胞及腦組織中均有表達(dá)，可調(diào)節(jié)正常和惡性細(xì)胞的自我更新[10]。許多實(shí)驗表明，L3MBTLl正常表達(dá)對細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂有重要作用[11]。目前關(guān)于新鮮胚胎移植與冷凍胚胎移植對胎盤中印跡基因表達(dá)及新生兒出生體重的影響尚無定論。為了探討其確切機(jī)制，本研究收集了IVF-ET患者新鮮胚胎移植與冷凍胚胎移植分娩的胎盤，檢測印跡基因PEG10和L3MBTLI在兩種胎盤中的表達(dá)，為改善IVF/ICSI不良妊娠結(jié)局奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年6月至2021年3月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院行IVF/ICSI患者分娩的胎盤。納入標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)婦年齡21～38歲；無妊娠期合并癥及并發(fā)癥；均為單胎、足月分娩，胎兒無畸形。根據(jù)患者移植周期分為新鮮胚胎移植組(ET組，n=16)與冷凍胚胎移植組(FET組，n=16)。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)檢測胎盤中印記基因PEG10和L3MBTLI表達(dá)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)，孕婦知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 胎盤組織標(biāo)本處理 所有標(biāo)本均在胎盤娩出15min內(nèi)采集，取胎盤中央部位組織，避開出血、壞死及鈣化區(qū)域，洗凈血跡后置于適量RNA保存液，-80℃冰箱儲存。其余樣品用4%多聚甲醛溶液(PFA)固定。

1.2.2 qRT-PCR 根據(jù)生產(chǎn)商使用說明，使用Trizol(Takara,China)試劑提取胎盤組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Green (Takara,China)在Step One plus thermo cycler(Applied Biosystems)進(jìn)行real-time PCR，檢測PEG10、L3MBTL1表達(dá)水平。使用GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)Y(jié)果進(jìn)行歸一化處理，采用2-△△Ct法對目的基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。引物序列：PEG10-F 5'-ACCTCTTGGACTTCTGAAT-3'；PEG10-R 5'-TCTTGGAACTGTCTGTATCT-3'；L3MBTL1-F 5'-GTTGACTAGCATTGTGTTCTG-3'；L3MBTL1-R 5'-ATCACCTCCTTGGACCTT-3'；GAPDH-qF 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'；GAPDH-qR 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.2.3 Western blot 蛋白裂解液(Thermo Fisher,Carlsbad,CA,USA)處理胎盤組織，提取總蛋白。采用BCA Protein Assay Kit (Solarbio,Beijing,China)檢測各蛋白濃度，制備蛋白樣品。SDS-PAGE凝膠電泳反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，依次加一抗、二抗孵育，避光條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)，洗滌晾干后進(jìn)行掃描分析。

1.2.4 IHC 對固定在PFA中的胎盤樣品進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋石蠟。石蠟切片脫蠟入水，3% H2O2溶液室溫孵育10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。滴加一抗和二抗工作液，用二氨基苯并(DAB)和底物緩沖液處理3～5min。將切片用蘇木精復(fù)染(Sigma，美國)，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料比較 FET組與ET組孕婦年齡、孕周、孕前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、孕期增重、胎盤重量及新生兒體重比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)ET組新生兒出生體重較ET組有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 ET組與FET組一般資料的比較

2.2 兩組患者胎盤組織中PEG10和L3MBTL1表達(dá) ET組的PEG10 mRNA和蛋白表達(dá)顯著低于FET組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而兩組的L3MBTL1 mRNA和蛋白表達(dá)水平無顯著差異。見圖1、表2。

2.3 免疫組化法結(jié)果 IHC檢測結(jié)果顯示，PEG10、L3MBTL1均在胎盤間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中呈棕褐色表達(dá)，細(xì)胞核不著色。FET組胎盤組織中PEG10蛋白的信號強(qiáng)度高于ET組，兩組的L3MBTL1蛋白信號強(qiáng)度無明顯差異(圖2)，與Western blot檢測結(jié)果一致。

表2 兩組胎盤組織中PEG10和L3MBTL1 mRNA

3 討 論

ART包括人工授精和體外受精-胚胎移植技術(shù)，近年來胚胎冷凍已成為ART中的常規(guī)程序，在ART中扮演著重要角色[12]。隨著胚胎冷凍保存技術(shù)的發(fā)展，冷凍胚胎的質(zhì)量和植入潛力與新鮮胚胎相似[13]。幾項大型隊列研究表明，與新鮮的IVF-ET相比，F(xiàn)ET周期出生的單胎中，新生兒出生體重增加，PTB和LBW發(fā)生率較低[14-15]。Pelkonen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ET周期出生的新生兒低出生體重(LBW)、小于胎齡兒(small for gestational age，SGA)的風(fēng)險均低于ET周期。研究發(fā)現(xiàn)，控制性卵巢刺激產(chǎn)生的高雌激素和孕酮濃度可能影響著床相關(guān)基因，損害早期胚胎植入和后期胎兒的生長[17]。此外，高雌激素水平還會干擾子宮內(nèi)膜血管生成，這可能影響胎盤的功能。FET移植時患者體內(nèi)雌孕激素水平更接近生理狀態(tài)，對子宮內(nèi)膜容受性和早期著床有積極的影響，更有利于胎盤的植入和發(fā)育。

胎盤的功能可能受多種因素的調(diào)節(jié)，大量研究證實(shí)，表觀遺傳機(jī)制在胎盤的發(fā)育過程中起著重要作用，對早期胚胎分化和發(fā)育、胎兒生長、胎盤分化和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要，基因印記紊亂可能導(dǎo)致子代發(fā)育異常、妊娠并發(fā)癥風(fēng)險增加[18]。本研究中，PEG10和L3MBTL1都是父源性表達(dá)的印記基因。Moore等[19]在2015年的研究中表明父系表達(dá)的基因促進(jìn)胎兒生長，而母系表達(dá)的基因抑制胎兒生長。PEG10可改善妊娠期新陳代謝，促進(jìn)孕激素的合成，有利于胎盤植入和胚胎發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，胎盤中PEGl0 mRNA及蛋白表達(dá)在FET組明顯高于ET組；FET組新生兒出生體重也較ET組有增加趨勢。梁小妍等關(guān)于胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)和印記基因PEG10的研究中發(fā)現(xiàn)，PEG10過度甲基化后，轉(zhuǎn)錄活性減弱,PEG10蛋白表達(dá)降低,抑制了滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖分化和浸潤,從而導(dǎo)致FGR的發(fā)生[20]。研究發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜中PEG10表達(dá)顯著下調(diào)[21]。Smallwood等[22]在動物實(shí)驗中也發(fā)現(xiàn)了敲除PEG10基因的小鼠，會引起胚胎發(fā)育異常，甚至導(dǎo)致胚胎早期死亡、流產(chǎn)。Lim等[23]研究發(fā)現(xiàn)，越低出生體重兒臍血中PEG10表達(dá)越低。這些研究都表明PEG10在胎兒和胎盤發(fā)育過程中起到重要作用[24]。本研究結(jié)果與這些早期研究成果一致。

L3MBTL1在生殖細(xì)胞和生殖干細(xì)胞早期階段均有表達(dá)，并參與人類胚胎干細(xì)胞增殖，影響胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)外胚層分化，L3MBTL1基因缺陷可抑制生殖干細(xì)胞染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄[25]。L3MBTL1下調(diào)可能增加ART患者流產(chǎn)和胚胎停育的風(fēng)險，增加子代患印記基因疾病的風(fēng)險。此前研究報道，ART子代與正常自然受孕子代L3MBTL1基因的表達(dá)存在差異[26]。但本研究FET組與ET組胎盤中L3MBTL1表達(dá)無顯著差異,提示不同移植周期對L3MBTL1的表達(dá)無明顯影響，也可能是由于本實(shí)驗樣本量限制造成。盡管人們對人類印跡基因的興趣日益增長，并且認(rèn)識到表觀遺傳學(xué)在人類發(fā)育中的重要性，但是關(guān)于印跡基因在人類胎盤發(fā)育和胚胎發(fā)生中的作用的認(rèn)識仍有限，對于不同移植周期是否影響印跡基因的表達(dá)還需進(jìn)行深入的研究。