劉艷嬌，李淑紅，白利穎，曹冬焱，楊佳欣，沈 鏗，孫恒子**

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100020；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730)

近年來，隨著三孩政策開放及篩查手段的提高，妊娠合并宮頸病變也被更多的發(fā)現(xiàn)并引起更多的關(guān)注。根據(jù)我國《妊娠合并子宮頸癌管理的專家共識》[1]，當(dāng)細(xì)胞學(xué)為意義不明的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance,ASC-US)且高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)檢測陽性者低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL),不典型鱗狀細(xì)胞傾向上皮內(nèi)高度病變(atypical squamous cells not except high lesion,ASC-H)及高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)及以上病變者應(yīng)轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查，根據(jù)檢查情況行宮頸活檢。然而，約48%～86%的妊娠期宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變能自然消退[2-3]。子宮頸癌篩查的研究顯示，聯(lián)合檢測有效提高了宮頸癌篩查的有效性，但仍有超過60%的患者轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查，但病理結(jié)果提示組織學(xué)LSIL及以下[4]。孕期反復(fù)陰道鏡檢查可能增加患者的焦慮和擔(dān)憂，降低患者的依從性[5]。因此，探索更多的妊娠期持續(xù)組織學(xué)HSIL高危標(biāo)志物，以提高診斷的準(zhǔn)確性并降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率是妊娠期宮頸癌防治工作中亟待解決的問題之一。

近年來，細(xì)胞學(xué)p16/Ki-67雙染被提議作為陰道鏡分流的生物標(biāo)志物。然而，Ciavattini等[6]研究認(rèn)為，妊娠期特殊的激素水平和生理環(huán)境可干擾參與細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白表達(dá)，導(dǎo)致p16/Ki67染色陽性與宮頸病變的相關(guān)性差于非妊娠期，影響結(jié)果的判定。p16/Ki67染色在妊娠期宮頸病變中的應(yīng)用價(jià)值尚需更多循證學(xué)依據(jù)。我們既往研究顯示，p16聯(lián)合細(xì)胞形態(tài)及HPV感染相關(guān)標(biāo)記物SMAD3、YAP1、RELA高表達(dá)檢出組織學(xué)HSIL較p16/Ki-67具有更高的靈敏度和特異性，提示p16與SMAD3、YAP1、RELA可能與宮頸上皮內(nèi)病變進(jìn)展密切相關(guān)[7]。本研究擬評估p16、Ki-67與細(xì)胞形態(tài)及HPV感染相關(guān)基因SMAD3、YAP1、RELA的表達(dá)與妊娠期宮頸病變轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，探索妊娠期持續(xù)組織學(xué)HSIL相關(guān)高危標(biāo)志物，以期為妊娠期宮頸病變患者提供更精準(zhǔn)的臨床診療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年1月至2020年1月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院及中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院確認(rèn)妊娠并定期產(chǎn)檢的患者。嚴(yán)格篩選妊娠建檔后行細(xì)胞學(xué)及HPV檢查，納入檢查結(jié)果異常轉(zhuǎn)診陰道鏡并行宮頸活檢的患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠前從未行HPV及TCT檢查或妊娠前末次檢查(1年以上)結(jié)果無異常；(2)孕期產(chǎn)檢TCT異常和(或)高危型HPV陽性；(3)孕期陰道鏡檢查可疑，簽署知情同意書后行宮頸活檢病理檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并免疫缺陷、嚴(yán)重肝腎功能異常、嚴(yán)重全身系統(tǒng)性疾病者；(2)任何原因于妊娠28周前終止妊娠者；(3)宮頸病變篩查與宮頸活檢間隔超過6個月；(4)宮頸活檢組織不足，無法完成后續(xù)研究要求者。收集患者的一般資料、孕產(chǎn)次、TCT及HPV結(jié)果、陰道鏡病理等結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并免疫缺陷、嚴(yán)重肝腎功能異常、嚴(yán)重全身系統(tǒng)性疾病者；(2)任何原因于妊娠28周前終止妊娠者；(3)宮頸病變篩查與宮頸活檢間隔超過6個月；(4)宮頸活檢組織不足，無法完成后續(xù)研究要求者。

1.2 研究方法 復(fù)核入組患者陰道鏡病理后取活檢病理蠟塊切片4μm，梯度二甲苯脫蠟及乙醇水洗，沖洗切片3次。將洗后切片置于pH 9.0的EDTA中，置微波爐中加熱至沸騰，冷卻5min，重復(fù)4次，修復(fù)完畢后冷卻至室溫。3%過氧化氫液，37℃孵育10min。沖洗切片3次。滴加山羊血清封閉液，37℃濕盒中孵育10min，吸水紙吸干。滴加稀釋后一抗，4℃孵育過夜，沖洗切片3次。37℃濕盒孵育1h。沖洗切片3次。孵育二抗30min。沖洗切片3次。滴加DAB顯色液，蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染60s，蒸餾水沖洗。鹽酸酒精分化2s，蒸餾水沖洗。脫水，透明及中性樹脂封片。研究中抗體均購自美國Abcam公司。一抗的濃度：p16(1∶1000)、Ki-67(1∶1000)、SMAD3(1∶2000)、YAP1(1∶1000)和RELA(1∶2000)。PBS溶液為陰性對照。

1.3 結(jié)果判讀 根據(jù)LAST中HPV相關(guān)病變的標(biāo)準(zhǔn)化方案(The Lower Anogenital Squamous Terminology Standardization project for HPV-associated lesions)[8]，p16陽性染色被定義為基底細(xì)胞層的持續(xù)強(qiáng)核或核+細(xì)胞質(zhì)染色，向上延伸至少涉及三分之一上皮層。其他染色類型如僅細(xì)胞質(zhì)、斑點(diǎn)狀、水坑狀、散在或單細(xì)胞陽性為陰性染色。Ki-67、SMAD3、YAP1和RELA陽性染色判定[7]：選擇5個隨機(jī)顯微鏡視野來評估半定量染色。免疫組化染色強(qiáng)度:+，弱(1分)；++，中等(2分)；+++，強(qiáng)(3分)。每個視野中陽性鱗狀上皮細(xì)胞面積:+，0%～33%(1分)；++，33%～66%(2分)；+++，66%～100%(3分)。將免疫組化染色強(qiáng)度得分及染色陽性面積得分2個分?jǐn)?shù)乘積后再乘以常數(shù)5得到5到45之間的染色總評分。0～17分：低表達(dá)(-)，18～45分：高表達(dá)(+)。對于陽性細(xì)胞的數(shù)量沒有明確的定量標(biāo)準(zhǔn)。判讀由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行，判讀結(jié)果不一致時(shí)由第三位病理科醫(yī)師判讀。

1.4 隨訪 收集患者產(chǎn)后6～12周復(fù)查TCT及HPV結(jié)果，異常結(jié)果行陰道鏡活檢者，追訪患者活檢病理結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件，分子標(biāo)記物表達(dá)與宮頸病變之間的相關(guān)性采用卡方檢驗(yàn)(Fisher精確檢驗(yàn))。采用敏感度、特異度、約登指數(shù)和ROC曲線下面積(Area Under Curve,AUC)等指標(biāo)評價(jià)診斷試驗(yàn)效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 入組患者一般資料 患者年齡為21～42歲，中位年齡為33歲。患者產(chǎn)前TCT結(jié)果：ASCUS合并高危HPV陽性患者28例，LSIL患者44例，ASC-H患者8例，HSIL患者42例。陰道鏡活檢病理為組織學(xué)LSIL及以下病變者共60例，其中包括宮頸良性病變24例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ 36例；組織學(xué)HSIL病變共62例，其中包括CINⅡ 42例，CINⅢ 19例以及原位癌1例。見表1。

表1 入組患者孕期聯(lián)合篩查及活檢病理結(jié)果

2.2 相關(guān)分子標(biāo)志物在不同宮頸病變中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，62例組織學(xué)HSIL中，p16高表達(dá)(p16+)共42例，Ki-67高表達(dá)(Ki-67+)共30例，SMAD3高表達(dá)(SMAD3+)共24例，YAP1高表達(dá)(YAP1+)共27例，RELA高表達(dá)(RELA+)共38例；60例組織學(xué)LSIL中，p16+共14例，Ki-67+共11例，SMAD3+共17例，YAP1+共9例，RELA+共12例。組織學(xué)HSIL中p16(P<0.001)、Ki-67(P=0.004)、YAP1(P<0.001)和RELA(P<0.001)表達(dá)均明顯高于組織學(xué)LSIL及以下病變；SMAD3在不同病變的表達(dá)無明顯差異(P=0.225)。見圖1。

2.3 聯(lián)合分子標(biāo)志物診斷產(chǎn)后高級別上皮內(nèi)病變的效能評價(jià) 產(chǎn)后6～12周內(nèi)共109例患者再次行聯(lián)合篩查，其中86例患者再次行陰道鏡檢查活檢，病理結(jié)果為組織學(xué)HSIL病變?yōu)?5例，其中CINⅡ 33例(5例由孕期組織學(xué)LSIL進(jìn)展為CINⅡ，9例由孕期組織學(xué)CINⅢ消退為CINⅡ，16例孕期組織學(xué)CINⅡ消退為LSIL及以下)，CINⅢ 12例(2例由CINⅡ進(jìn)展為CINⅢ)，HSIL自然消退率為47.5%。聯(lián)合免疫組化分析，結(jié)果顯示單獨(dú)p16+診斷產(chǎn)后組織學(xué)HSIL較p16+聯(lián)合Ki-67+具有更高的敏感度(68.9% vs 26.7%，P<0.001)，但特異度較低(65.6% vs 84.4%，P=0.014)；p16+聯(lián)合RELA+較p16+聯(lián)合Ki-67+具有相當(dāng)?shù)奶禺惗?89.1% vs 84.4%，P=0.435)，但敏感度較低(57.8% vs 26.7%，P=0.003)；p16+聯(lián)合RELA+和(或)YAP1+較單獨(dú)p16+具有相當(dāng)?shù)拿舾卸?66.7% vs 68.9%，P=0.822)及更高的特異度(84.4% vs 65.6%，P=0.014)。p16+聯(lián)合RELA+和(或)YAP1+具有最高的約登指數(shù)0.510。見表2。ROC曲線提示p16+聯(lián)合RELA+和(或)YAP1+診斷產(chǎn)后組織學(xué)HSIL具有最大曲線下面積0.747(95%CI=0.650～0.845)。見表2、圖2。

表2 聯(lián)合分子標(biāo)志物診斷產(chǎn)后高級別上皮內(nèi)病變的效能評價(jià)

3 討 論

隨著我國三孩政策的開放，孕產(chǎn)婦總?cè)藬?shù)及高危孕產(chǎn)婦比例升高，妊娠合并宮頸癌發(fā)病也將呈上升趨勢。研究顯示，妊娠期組織學(xué)確診的HSIL仍具有較高的自然轉(zhuǎn)歸率，然而其原因仍不清。

Ahdoot等[9]研究認(rèn)為，孕期多次行宮頸活檢，導(dǎo)致部分或全部病灶被去除，從而使產(chǎn)后病變自然轉(zhuǎn)陰率提高。此外，一些研究認(rèn)為，在陰道鏡活檢過程中宮頸上皮完整性的破壞可能引發(fā)局部免疫反應(yīng)，導(dǎo)致病灶的轉(zhuǎn)歸[3]。分娩方式對妊娠期HSIL的轉(zhuǎn)歸影響仍存在爭議。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，陰道分娩較剖宮產(chǎn)具有更高的轉(zhuǎn)歸率(67% vs 13%)[10]。Para等[11]認(rèn)為，其機(jī)制可能是宮頸創(chuàng)傷，尤其是在分娩過程中發(fā)生的創(chuàng)傷可能導(dǎo)致宮頸上皮的炎癥反應(yīng)，或?qū)m頸成熟過程中發(fā)育不良的宮頸上皮丟失，以及胎兒通過產(chǎn)道的過程導(dǎo)致病變處的宮頸上皮受損修復(fù)過程中被正常上皮所替代所致。另外，陰道分娩期間的短暫缺血性變化可能與產(chǎn)后宮頸病變的消退相關(guān)[12]。近年來，也有部分研究并未發(fā)現(xiàn)分娩方式與產(chǎn)后宮頸病變的轉(zhuǎn)歸之間存在任何關(guān)聯(lián)[13]。其認(rèn)為妊娠特殊的激素水平導(dǎo)致孕婦免疫力降低，因此孕期易導(dǎo)致HPV感染及宮頸病變，并根據(jù)孕期與非孕期宮頸病變病灶中Ki-67表達(dá)差異推測妊娠期特殊的激素水平及免疫機(jī)制可能影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)從而干擾高危HPV誘導(dǎo)的致癌過程，進(jìn)而干擾病變進(jìn)展。另一方面，由于產(chǎn)后激素水平和免疫力的恢復(fù)，產(chǎn)婦HPV感染逐漸轉(zhuǎn)陰，使妊娠期宮頸病變自然消退率增加[6，13]。

目前關(guān)于妊娠期宮頸上皮內(nèi)病變高危標(biāo)志物的研究仍較少，妊娠期行陰道鏡活檢的獲益可能仍較低。本研究中妊娠期HPV及TCT篩查結(jié)果異常后行陰道鏡活檢檢出組織學(xué)HSIL為50.8%。因此，有必要探索有效的標(biāo)志物，以避免過度診療和不必要的侵入性檢查。

p16基因產(chǎn)物是一種細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制劑，持續(xù)性HPV感染伴隨的細(xì)胞異常增生會導(dǎo)致p16過表達(dá)。Galgano等報(bào)告，p16免疫染色檢出組織學(xué)HSIL的敏感度為86.7%,特異度為82.8%[14]。Ki-67是一種標(biāo)志細(xì)胞增殖的核抗原。在正常細(xì)胞中，p16和Ki67表達(dá)相互拮抗，p16與Ki67同時(shí)過表達(dá)提示細(xì)胞周期調(diào)控失衡，存在病變。LAST指南中提議，H&E染色形態(tài)學(xué)鑒別存在爭議時(shí)，可進(jìn)一步行p16染色以提高HSIL診斷的一致性。p16陽性的CINⅡ建議歸為HSIL，p16/Ki67陰性的CINⅡ建議歸為LSIL[8]。

SMAD3是一種介導(dǎo)多種信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在癌癥發(fā)生的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。最近的研究表明，Twist在宮頸癌發(fā)生過程中通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad3信號通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，并且TGF-β/Smad3信號的激活可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞系的遷移和侵襲[15]。YAP1編碼Hippo信號通路的下游核內(nèi)效應(yīng)器，參與發(fā)育、生長、修復(fù)和體內(nèi)平衡。YAP1蛋白在浸潤性宮頸癌和宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變中均上調(diào)，YAP1與HPV感染相關(guān)，HPV E6蛋白可抑制YAP1蛋白的降解，HPV E7蛋白通過靶向PTPN14促進(jìn)YAP1蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)。HPV E6/E7誘導(dǎo)的YAP1蛋白積累及其釋放到細(xì)胞核的組合導(dǎo)致YAP1的劇烈活化，這可能是其促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞增殖并最終導(dǎo)致宮頸癌變的機(jī)制[16-17]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)與許多癌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，其在細(xì)胞增殖、遷移、血管生成和凋亡多種基因功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RELA是NF-κB1基因的產(chǎn)物并與該基因復(fù)合形成NF-κB最豐富的形式。而HPV感染能促進(jìn)RELA表達(dá)增加，HPV16通過HPV E6/E7癌基因的過表達(dá)及其與NF-κB的功能相互作用促進(jìn)HPV所致腫瘤的進(jìn)展及分化，且RELA過表達(dá)與宮頸腫瘤的進(jìn)展相關(guān)[18-19]。最近，有研究者通過系統(tǒng)分析細(xì)胞形態(tài)相關(guān)基因與關(guān)鍵EMT轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，證實(shí)SMAD3、RELA和YAP1在細(xì)胞形態(tài)信息傳感方面發(fā)揮了重要作用[20]。

既往對宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的研究發(fā)現(xiàn)，p16聯(lián)合SMAD3/RELA/YAP1的高表達(dá)在檢出組織學(xué)HSIL中具有良好的敏感度和特異度[7]。本研究結(jié)果顯示，在妊娠期宮頸上皮內(nèi)病變中除SMAD3外，p16等在宮頸高級別上皮內(nèi)病變中的表達(dá)明顯升高，且p16+聯(lián)合RELA+和(或)YAP1+較p16+、Ki-67+在診斷產(chǎn)后組織學(xué)HSIL中同時(shí)具有更高的敏感度及特異度，且具有最大ROC曲線下面積，在診斷妊娠期持續(xù)組織學(xué)HSIL中具有更好的效能。推測可能是由于持續(xù)HPV感染導(dǎo)致妊娠期宮頸病變中p16過表達(dá)。而YAP1、RELA與HPV感染所致宮頸病變的進(jìn)展密切相關(guān)，更重要的是，兩者均在病變細(xì)胞形態(tài)改變過程中發(fā)揮重要作用。因此，p16聯(lián)合RELA和(或)YAP1的異常表達(dá)，能從分子水平反應(yīng)出妊娠期持續(xù)性HPV感染引起的宮頸上皮細(xì)胞周期表達(dá)異常及細(xì)胞形態(tài)的改變，提示病變有進(jìn)展可能，從而提高診斷的敏感度及特異度。而病灶中Ki-67的表達(dá)受妊娠期特殊的激素水平及免疫機(jī)制的影響無法準(zhǔn)確反應(yīng)出病變進(jìn)展的情況。然而，對p16、YAP1及RELA對妊娠期宮頸病變進(jìn)展的影響機(jī)制仍需更進(jìn)一步的探索。

本研究通過對陰道鏡活檢病理免疫組化染色，探索對妊娠期宮頸病變持續(xù)存在或進(jìn)展有提示意義的標(biāo)志物，以提高對持續(xù)性宮頸高級別上皮內(nèi)病變的檢出率，降低大部分能夠自然轉(zhuǎn)歸產(chǎn)婦在孕期行陰道鏡檢查的頻率。另一方面，為后續(xù)在妊娠期宮頸脫落細(xì)胞中相關(guān)標(biāo)志物的研究提供理論基礎(chǔ)，以期探索可以應(yīng)用于陰道鏡轉(zhuǎn)診前的分流方案。綜上所述，妊娠合并高級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者約半數(shù)以上可自然消退，p16、YAP1及RELA高表達(dá)對持續(xù)組織學(xué)HSIL有較高的診斷價(jià)值，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及相關(guān)細(xì)胞學(xué)研究。