張 琳,蔣錦杏,鄧春艷**,楊 熠,王若琳,任莉莉,齊 暉,馬利國(guó)

[深圳市人民醫(yī)院(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院) a.婦科；b.生物治療室，深圳 518020]

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)異癥，是指子宮內(nèi)膜組織在子宮腔以外出現(xiàn)異常生長(zhǎng)，是一種以痛經(jīng)、不孕為主要臨床表現(xiàn)的常見(jiàn)女性生殖系統(tǒng)疾病，在育齡婦女中發(fā)病率達(dá)10%[1]。目前內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制仍不明確，從“經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)”到“在位內(nèi)膜決定論”[2]。從異位病灶細(xì)胞的“干細(xì)胞學(xué)說(shuō)”[3]到類(lèi)似惡性腫瘤細(xì)胞的“高侵襲性”[4]，遺傳、內(nèi)分泌、免疫、微生物和環(huán)境等因素均已被報(bào)道與EMs的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。因此，從多種角度分析異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的差異，將為EMs的發(fā)病機(jī)制與治療提供更好的指導(dǎo)。

拉曼光譜技術(shù)是研究代謝組學(xué)的方法學(xué)之一，通過(guò)對(duì)光譜的位置、強(qiáng)度和寬度進(jìn)行分析，可獲得樣品中最相關(guān)的生物分子(蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖和核酸等)的獨(dú)特分子指紋，已被用于評(píng)估亞細(xì)胞水平上可能伴隨疾病發(fā)生的特定生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞活動(dòng)、代謝和氧化應(yīng)激等[5]。單細(xì)胞激光光鑷?yán)庾V技術(shù)是是結(jié)合光學(xué)囚禁技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)懸浮單個(gè)細(xì)胞的研究，可更精準(zhǔn)便捷地獲取單細(xì)胞水平的代謝或生化特征[6]。本研究采用該技術(shù)分析比較內(nèi)異癥及子宮肌瘤對(duì)照患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞拉曼光譜，從分子代謝水平上探討EMs的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年10月至2019年10月深圳市人民醫(yī)院收治的內(nèi)異癥患者共9例，年齡30～43歲，月經(jīng)規(guī)律，周期28～32d，無(wú)其它內(nèi)外科合并癥，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未服用激素類(lèi)藥物；經(jīng)術(shù)中腹腔鏡檢查及病理檢測(cè)確診，按美國(guó)生育學(xué)會(huì)分期法(R-AFS)，患者均為Ⅲ～I(xiàn)V期盆腔EMs，留取在位、異位內(nèi)膜組織分別為內(nèi)異癥A組、B組。選擇同期行子宮肌瘤切除術(shù)的6例患者，年齡32～46歲，留取內(nèi)膜組織作為對(duì)照組(病理證實(shí)均為正常子宮內(nèi)膜組織)。兩組患者的年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),所取內(nèi)膜均為增生期內(nèi)膜。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣品處理 新鮮子宮內(nèi)膜組織用D-Hanks液(Sigma-Aldrich公司)沖洗3次，剪成約(0.5～1.0)mm3大的碎塊，置于帶蓋的15ml離心管，加4～5mL預(yù)熱至37℃的IV型膠原酶(2mg/mL，Gibco公司)，混勻，置37℃水浴鍋中消化。每5～10min用吸管輕輕吹打細(xì)胞，20min后取出靜置片刻，待組織下沉后，吸出2/3上清液轉(zhuǎn)移至新的15 mL離心管，加含DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco公司)終止消化。剩余1/3再補(bǔ)加新的膠原酶液繼續(xù)消化，消化時(shí)間20～30min，取上清液加含DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。將兩次消化的細(xì)胞液以300g離心5min，吸除上清，細(xì)胞沉淀物用PBS液漂洗2遍，加4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich公司)固定，洗滌，加PBS液(Sigma-Aldrich公司)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 拉曼光譜獲取 拉曼測(cè)量采用BioRam?激光共聚焦拉曼-光鑷顯微鏡(CellTool GmbH，德國(guó))進(jìn)行，使用785nm波長(zhǎng)、80mw功率的二極管激光器進(jìn)行拉曼激發(fā)。散射光束通過(guò)60×水浸物鏡 (Olympus，德國(guó))收集，校正環(huán)設(shè)置為0.17mm。分析時(shí)將100μL細(xì)胞懸浮液置于75×25mm細(xì)胞培養(yǎng)微孔板(貨號(hào)：543079，Greiner Bio-One GmbH，德國(guó))，每個(gè)樣品隨機(jī)測(cè)量60個(gè)細(xì)胞，采集次數(shù)10次，曝光時(shí)間3s，光譜范圍400～1800cm-1，該波段包含最有用的生物學(xué)信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得光譜導(dǎo)入儀器配套軟件CT-RamSES(CellTool GmbH，德國(guó))進(jìn)行基線(xiàn)校正、去熒光、降噪及歸一化等處理，以獲得較為理想的細(xì)胞拉曼光譜信號(hào)。采用主成分分析(PCA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。PCA得分圖用于在數(shù)據(jù)中尋找聚類(lèi)，根據(jù)PCA載荷找到在被分析組之間顯示顯著光譜變化的相應(yīng)位置。使用GraphPad Prism7.04對(duì)不同組別波峰強(qiáng)度進(jìn)行比較分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 拉曼光譜峰值和對(duì)應(yīng)的物質(zhì)指認(rèn) 本研究共獲得子宮內(nèi)膜細(xì)胞拉曼光譜共20例，包含對(duì)照組患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞6例，內(nèi)異癥患者在位和異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞各7例，其中5例內(nèi)異癥患者同時(shí)獲得了在位和異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的光譜。細(xì)胞光譜的拉曼峰位參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行歸屬，見(jiàn)表1。3組樣本的平均光譜見(jiàn)圖1，陰影表示標(biāo)準(zhǔn)差。在波數(shù)為400～1800cm-1之間可見(jiàn)3組細(xì)胞拉曼光譜波峰位置及形態(tài)大致相似，對(duì)照組與內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的拉曼光譜更為接近，部分波峰強(qiáng)度有差異，可充分反映出不同組別子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)生物大分子的含量和成分。

表1 子宮內(nèi)膜細(xì)胞拉曼光譜的峰位歸屬

PCA得分圖顯示，PC1(50.06%)、PC2(10.02%)、PC3(8.28%)共可以解釋數(shù)據(jù)集變量68.36%的變異度，對(duì)照組(Ctrl，藍(lán)色點(diǎn))和內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞(EMs-A，綠色點(diǎn))差異較小，散點(diǎn)分布出現(xiàn)較大重疊，而內(nèi)異癥患者異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞(EMs-B，紅色點(diǎn))出現(xiàn)較大偏移。PCA載荷圖提示，PC1、PC2、PC3分別于1445(蛋白質(zhì)、脂類(lèi))、1525(類(lèi)胡蘿卜素)、1663(蛋白質(zhì)、膠原、核酸)cm-1呈最大相關(guān)性。

2.2 內(nèi)異癥組在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞與對(duì)照組比較 內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞與對(duì)照組拉曼峰的形態(tài)和位置呈現(xiàn)較好的一致性，兩組之間最顯著的光譜差異用黃色方框標(biāo)出(圖2A)。與對(duì)照組相比，內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在702(膽固醇)cm-1的波峰強(qiáng)度降低，在938(碳水化合物)、1005(蛋白質(zhì)-苯丙氨酸、類(lèi)胡蘿卜素)、1161(類(lèi)胡蘿卜素、蛋白)、1525(類(lèi)胡蘿卜素)cm-1的波峰強(qiáng)度增高(圖2A)。以PC1(55.06%)、PC2(12.42%)、PC3(5.91%)繪制的PCA聚類(lèi)圖中，兩組細(xì)胞分布高度重疊，未形成獨(dú)立的分群(圖2B)。PCA載荷圖提示PC1、PC2、PC3分別于1445(蛋白、脂類(lèi))、1525(類(lèi)胡蘿卜素)、1161(類(lèi)胡蘿卜素)cm-1呈最大相關(guān)性(圖2C)。

2.3 內(nèi)異癥組異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞與對(duì)照組比較 內(nèi)異癥患者異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞與對(duì)照組拉曼峰的形態(tài)和位置大致相似，但多個(gè)波峰強(qiáng)度出現(xiàn)差異(圖3A)。與對(duì)照組相比，內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在492(糖原)、758(蛋白質(zhì)-色氨酸)、831(蛋白質(zhì)-脯氨酸、酪氨酸)、853(蛋白質(zhì)-酪氨酸)、960(膽固醇)、1132(脂類(lèi))、1209(蛋白質(zhì)-酪氨酸、苯丙氨酸)、1245(蛋白質(zhì)、膠原)、1589(蛋白質(zhì)-苯丙氨酸)、1620(蛋白質(zhì)-色氨酸)cm-1的波峰強(qiáng)度增高，在702(膽固醇)、720(脂類(lèi)、核酸)、1094(核酸)、1161(類(lèi)胡蘿卜素、蛋白質(zhì))、1445(脂類(lèi)、蛋白質(zhì))、1525(類(lèi)胡蘿卜素)、1663(蛋白質(zhì)、膠原、核酸)cm-1的波峰強(qiáng)度降低。使用PC1(49.93%)、PC2(10.97%)、PC3(7.25%)繪制的PCA聚類(lèi)圖中，兩組細(xì)胞部分重疊，內(nèi)異癥患者部分異位內(nèi)膜細(xì)胞離群(圖3B)。PCA載荷圖(圖3C)提示PC1和PC2均與1445(蛋白、脂類(lèi))cm-1呈最大相關(guān)性，PC3與1161(類(lèi)胡蘿卜素)cm-1呈最大相關(guān)性。

2.4 內(nèi)異癥組在位與異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞比較 內(nèi)異癥患者異位與在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞多個(gè)波峰強(qiáng)度出現(xiàn)差異(圖4A)。與在位內(nèi)膜相比，內(nèi)異癥患者異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在492(糖原)、758(蛋白質(zhì)-色氨酸)、831(蛋白質(zhì)-脯氨酸、酪氨酸)、853(蛋白質(zhì)-酪氨酸)、1132(脂類(lèi))、1209(蛋白質(zhì)-酪氨酸、苯丙氨酸)、1245(蛋白質(zhì)、膠原)、1589(蛋白質(zhì)-苯丙氨酸)、1620(蛋白質(zhì)-色氨酸)cm-1的波峰強(qiáng)度增高，在720(脂類(lèi)、核酸)、938(碳水化合物、膠原)、1005(蛋白質(zhì)-苯丙氨酸、類(lèi)胡蘿卜素)、1094(核酸)、1161(類(lèi)胡蘿卜素、蛋白質(zhì))、1445(脂類(lèi)、蛋白質(zhì))、1525(類(lèi)胡蘿卜素)、1663(蛋白質(zhì)、膠原、核酸)cm-1的波峰強(qiáng)度降低。使用PC1(48.06%)、PC2(11.90%)、PC3(8.04%)繪制的PCA聚類(lèi)圖中，兩組細(xì)胞部分重疊，內(nèi)異癥患者部分異位內(nèi)膜細(xì)胞離群(圖4B)。PCA載荷圖(圖4C)提示PC1、PC2、PC3分別與1445(蛋白、脂類(lèi))、1663(蛋白質(zhì)、膠原、核酸)、1161(類(lèi)胡蘿卜素)cm-1呈最大相關(guān)性。

來(lái)源于同一患者的在位與異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞拉曼平均光譜如圖5A。與在位內(nèi)膜相比，該患者的異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在492(糖原)、758(蛋白質(zhì)-色氨酸)、831(蛋白質(zhì)-脯氨酸、酪氨酸)、853(蛋白質(zhì)-酪氨酸)、1005(蛋白質(zhì)-苯丙氨酸、類(lèi)胡蘿卜素)、1132(脂類(lèi))、1209(蛋白質(zhì)-酪氨酸、苯丙氨酸)、1245(蛋白質(zhì)、膠原)、1589(蛋白質(zhì)-苯丙氨酸)、1620(蛋白質(zhì)-色氨酸)cm-1的波峰強(qiáng)度增高，在702(膽固醇)、720(脂類(lèi)、核酸)、938(碳水化合物、膠原)、1094(核酸)、1161(類(lèi)胡蘿卜素、蛋白質(zhì))、1445(脂類(lèi)、蛋白質(zhì))、1525(類(lèi)胡蘿卜素)、1663(蛋白質(zhì)、膠原、核酸)cm-1的波峰強(qiáng)度降低。以PC1(58.53%)、PC2(13.22%)繪制的PCA聚類(lèi)圖中，該患者兩組不同來(lái)源的細(xì)胞分群明顯(圖5B)。

3 討 論

細(xì)胞內(nèi)許多生命活動(dòng)是發(fā)生在代謝物層面的，如細(xì)胞信號(hào)釋放、能量傳遞、細(xì)胞間通信等都是受代謝物調(diào)控的，代謝物更多地反映了細(xì)胞所處的環(huán)境。細(xì)胞代謝失調(diào)可導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的多種人類(lèi)疾病[7]。盡管現(xiàn)已廣泛認(rèn)為代謝組學(xué)在許多疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療監(jiān)測(cè)方面具有巨大的潛力，在該領(lǐng)域內(nèi)研究子宮內(nèi)膜異位癥仍處于初期階段[8]。基于核磁共振和質(zhì)譜方法學(xué)對(duì)EMs患者的子宮內(nèi)膜液[9]、內(nèi)膜組織[5]、卵泡液[10]、尿液[11]、血清[12]和血漿[13]進(jìn)行的代謝組學(xué)研究顯示，患者的代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著變化。拉曼光譜技術(shù)也是研究代謝組學(xué)的方法學(xué)之一，其譜帶的移動(dòng)和變化可以解釋為某些化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化，這可能影響細(xì)胞的功能并涉及疾病的發(fā)展[14]。Notarstefano等[15]將紅外和拉曼兩種光譜技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，揭示了由內(nèi)異癥病理引起的卵巢顆粒細(xì)胞代謝和生化組成的改變，包括蛋白質(zhì)模式的改變、氧化應(yīng)激機(jī)制的誘導(dǎo)以及脂質(zhì)和碳水化合物代謝的紊亂等。Parlatan等[16]使用拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)EMs患者和正常對(duì)照血清光譜，結(jié)合PCA和分類(lèi)算法，嘗試建立一種無(wú)創(chuàng)血清診斷EMs的方法。

本研究中，使用單細(xì)胞激光光鑷?yán)夹g(shù)為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)研究方法揭示了盆腔EMs(Ⅲ～Ⅳ期)患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞的代謝物變化。激光光鑷?yán)庾V分析技術(shù)是一種將激光光鑷與共聚焦拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，能保證在生理?xiàng)l件下捕獲、操控、測(cè)量在懸浮狀態(tài)下單個(gè)活細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)分析研究，作為一種有效的非標(biāo)記、無(wú)損傷的單個(gè)生物分子分析方法，在細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，EMs患者在位、異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞與對(duì)照組子宮肌瘤患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞拉曼峰的位置大致相同，但是存在波峰強(qiáng)度的差別。雖然收集到的拉曼光譜是多個(gè)大分子的綜合貢獻(xiàn)，但在譜帶強(qiáng)度方面，濃度較高的分子對(duì)光譜的貢獻(xiàn)更大。本結(jié)果提示，與患者在位子宮內(nèi)膜和對(duì)照組子宮內(nèi)膜相比，異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)膽固醇(702cm-1)、類(lèi)胡蘿卜素(1161、1525cm-1)、核酸(1094cm-1)等成分減少，而蛋白(758、831、853、1209、1245、1589cm-1)、脂類(lèi)(1132cm-1)、糖原(492cm-1)相關(guān)的成分增加，可能反映了其存在較強(qiáng)的細(xì)胞呼吸和增殖代謝。通過(guò)PCA聚類(lèi)分析可以看出，EMs患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞與對(duì)照組子宮內(nèi)膜細(xì)胞光譜相似性較高，而異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中出現(xiàn)離群細(xì)胞，提示異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞代謝出現(xiàn)了較大的改變。

EMs是激素依賴(lài)性疾病，內(nèi)膜細(xì)胞存在激素代謝的異常[2]。雌孕激素通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶刺激內(nèi)膜細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，在種植的病灶中異位內(nèi)膜細(xì)胞還可自我產(chǎn)生雌激素[17-18]。膽固醇作為甾體類(lèi)激素的前體物質(zhì)，在本研究中相關(guān)拉曼峰振動(dòng)強(qiáng)度表現(xiàn)為：異位內(nèi)膜最低，在位內(nèi)膜次之，均低于對(duì)照內(nèi)膜。這一變化提示EMs患者在位和異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)膽固醇消耗較多，從亞細(xì)胞水平更進(jìn)一步證實(shí)了EMs患者體內(nèi)的激素代謝異常，消耗的膽固醇可能正是被用于合成了甾體類(lèi)激素。

此外，EMs患者常伴有脂代謝異常[19]。患有EMs的婦女有較低的體質(zhì)量指數(shù)和體脂，其體內(nèi)脂肪干細(xì)胞水平較低并伴有脂肪代謝基因的改變[20]。EMs中相對(duì)升高的雌激素水平，通過(guò)雌激素受體，也可能直接或通過(guò)調(diào)控子宮內(nèi)膜外泌體，顯著抑制骨髓中脂肪細(xì)胞的生成[21]，以及脂肪細(xì)胞中甘油三酯的積累[22]。本研究提示，EMs患者異位內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)脂類(lèi)物質(zhì)聚集增加，可能涉及脂代謝通路異常的某些環(huán)節(jié)，相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果還揭示了EMs患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞中類(lèi)胡蘿卜素代謝的變化。Taylor等[23]研究表明，異位子宮內(nèi)膜組織中類(lèi)胡蘿卜素減少，而且EMs患者體內(nèi)維甲酸的代謝和作用從根本上是有缺陷的。Parlatan等[16]檢測(cè)的EMs患者血清拉曼光譜中也提示了類(lèi)胡蘿卜素的差異。類(lèi)胡蘿卜素在結(jié)構(gòu)上與維甲酸類(lèi)似，二者具有多種類(lèi)似的生物活性，如抗氧化性能、抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可影響細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)和免疫反應(yīng)，還能抑制細(xì)胞侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移，其抗炎活性也被認(rèn)為是其抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制[24]。內(nèi)異癥雖為良性疾病，但其細(xì)胞浸潤(rùn)、增生及復(fù)發(fā)等均屬于惡性生物學(xué)行為。已證實(shí)內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的間隙連接細(xì)胞間通訊功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)喪失與疾病的發(fā)病密切相關(guān)，而類(lèi)胡蘿卜素、維甲酸可上調(diào)或恢復(fù)內(nèi)異癥及某些腫瘤細(xì)胞的GJIC功能[25]。因此，推測(cè)EMs患者異位內(nèi)膜細(xì)胞中降低的類(lèi)胡蘿卜素水平可能有利于異位的子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生類(lèi)似于腫瘤特性的生長(zhǎng)。另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)，EMs患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的類(lèi)胡蘿卜素水平較對(duì)照組增加，提示機(jī)體可能存在某種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，或尚有其它混雜因素(例如免疫微環(huán)境)影響了細(xì)胞的代謝水平。

綜上所述，本研究采用單細(xì)胞激光光鑷?yán)庾V分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)EMs患者在位、異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞存在多種代謝改變。本研究中發(fā)現(xiàn)的這些改變所引起的影響可能是復(fù)雜的，在EMs中發(fā)生發(fā)展中的因果關(guān)系也尚不清楚，但這些生化代謝產(chǎn)物的變化反映了異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異常生物學(xué)特性，將為理解疾病的發(fā)生發(fā)展提供一種新的視野，也將有望提供新的治療靶點(diǎn)。