劉忠民，呂振磊，尹 超

(海南科技職業(yè)大學 健康科學學院，海南 ?？?71126)

運動應激已經(jīng)被證實可以改善認知機能退行性或輕度認知功能障礙，如阿爾茲海默病(AD)、帕金森等。運動應激使機體的抗氧化防御體系對運動產(chǎn)生適應性改變，增強免疫、神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性，減少星形膠質(zhì)細胞肥大和髓鞘失調(diào)，調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)細胞黏附分子(NCAM)等表達，進而延緩腦衰老[1]。解偶聯(lián)蛋白(UCPs)是線粒體轉運蛋白，其在線粒體內(nèi)膜上產(chǎn)生質(zhì)子泄漏，從而使氧化磷酸化與ATP合成解偶聯(lián)。線粒體是活性氧(ROS)產(chǎn)生的主要部位。已經(jīng)顯示，斑塊周圍誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達增加有助于AD腦中的氧化應激[2]。UCP是線粒體內(nèi)蛋白，通過減少自由基的產(chǎn)生來保護神經(jīng)元[3]。通過控制氧化應激調(diào)節(jié)細胞能量水平，人類UCP的遺傳變異性已被證明與長壽有關[4]。解偶聯(lián)蛋白4(UCP4)屬于解偶聯(lián)蛋白家族，其位于線粒體內(nèi)膜并通過線粒體呼吸鏈在電子傳遞過程中產(chǎn)生質(zhì)子電化學梯度。UCP4主要在腦組織中表達，包括海馬，皮質(zhì)，紋狀體和小腦。最近的研究表明，UCP4調(diào)節(jié)不同生物學功能諸如線粒體功能，氧化磷酸化，神經(jīng)元細胞存活和鈣調(diào)節(jié)等。小窩蛋白-1(Caveolin-1)是小窩結構的蛋白質(zhì)組分，在質(zhì)膜。雖然最初認為細胞膜穴樣內(nèi)陷起大分子運輸囊泡的作用[5]，但它們的作用已經(jīng)擴展到包括信號轉導，細胞代謝，細胞老化，膽固醇體內(nèi)平衡，內(nèi)吞作用及腫瘤的促進與抑制[6]。本研究通過運動應激上調(diào)海馬線粒體UCP4蛋白及控制Caveolin-1的分泌來改善神經(jīng)細胞線粒體功能，從而抑制氧化應激，達到對大腦認知障礙保護的作用。

1 材料和方法

1.1 動物

所有程序均由海南醫(yī)學院實驗動物中心批準，并根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院動物研究指南進行。6周齡SPF級雄性 Sprange-Dawley大鼠 40只(湖南實驗動物有限責任公司提供),隨機分為4組，對照組(C)、D-半乳糖注射組(D)、實驗組(DE)和運動組(E),體重350 g-400 g,大鼠均分籠飼養(yǎng)于海南醫(yī)學院動物實驗室，自由飲水與攝食，每隔一天定時清理鼠籠、更換墊料。環(huán)境溫度25℃，相對濕度60%-70%，自然晝夜交替。

1.2 D-半乳糖大鼠衰老模型

為了建立大鼠衰老模型，給D-半乳糖衰老組大鼠腹腔注射大劑量的D-半乳糖(取13 g D-半乳糖融入104 ml生理鹽水)，所有手術均在麻醉下進行，并努力減少痛苦。

1.3 運動應激大鼠模型的建立

根據(jù)BEDFORD 等[7]研究，運動模型采用中等強度的運動應激，完成分組后對照組不進行運動，運動組進行一周的適應訓練，逐漸加快跑臺速度，使其逐步適應實驗設計的訓練強度。跑臺坡度設為0，跑臺速度最終達到1.1 km/h,持續(xù)時間從20 min到60 min，每周6天訓練，為期8周。具體運動強度實施如表1所示。

表1 運動組大鼠運動強度

1.4 Morris水迷宮實驗

8周運動應激干預后各組大鼠進行水迷宮訓練，訓練方法采用周麗華[8]等人的研究方法，分為定位航行實驗和空間探索實驗。水迷宮訓練的環(huán)境為一個可隔音、隔光的實驗室。定位航行實驗：實驗為期5天，第一天讓各組大鼠進行2 min的自游泳，從第二天起，每組每天訓練四次，首先讓大鼠在站臺停留10 s，分別從4個不同象限面向池壁入水，找到并在站臺停留5 s結束采集，觀察并記錄其在水池中的路程圖、速度、潛伏期等，若120 s內(nèi)未找到站臺重新讓其在站臺上停留10 s，潛伏期記為120 s?？臻g探索實驗：在最后一次訓練結束后，撤掉站臺，觀察并記錄大鼠在120 s內(nèi)的站臺穿越次數(shù)、站臺所在象限路程和時間等。

1.5 準備腦組織及血清樣本

在每組中，使用6只大鼠進行生化分析，剩余的4只大鼠用于Western Blot和免疫組織化學測試。大鼠經(jīng)過第八周有氧訓練，第九周水迷宮測試完24小時后，腹腔注射10%的水合氯醛(生理鹽水，4 ml/kg體重)進行麻醉后，快速打開大鼠腹腔進行腹腔動脈取血，各組大鼠取血后靜置過夜，第二天離心去上清，將其儲存在-80℃下用于隨后的實驗。取血結束后用15 ml注射器抽取提前準備好的生理鹽水，從心尖進針插入左心室推至主動脈，灌注生理鹽水待大鼠肝臟變白后，仔細并迅速取出大鼠的腦組織。在冷板上立即剝離出海馬和皮質(zhì)，保存于液氮中用于生化分析。固定組更換4%多聚甲醛進行固定直到頸部及四肢僵硬為止。將固定組大鼠的腦儲存在4%磷酸鹽緩沖的多聚甲醛(在0.1M磷酸鹽緩沖液，pH 7.4中)中，用于組織病理學檢查和免疫組織化學測試。

1.6 免疫組化實驗方案

將切片進行脫蠟處理/再水化:用二甲苯浸洗切片3次，每次5 min用無水乙醇浸洗切片2次，共10 min。用95%乙醇浸洗切片2次，每次10 min，在蒸餾水中漂洗2次，每次5 min?？乖迯?加熱浸泡在10 mM pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中的玻片，使之維持在準沸騰的溫度(95-99℃)10 min。取出放在實驗臺上自然冷卻30 min。染色:切片用漂洗液洗兩次，每次5 min。浸泡在3% H2O2中孵育10 min。用蒸餾水漂洗兩次，每次5 min。用漂洗液洗5 min。在切片上滴加100-400 μl封閉液(進口羊血清工作液，中杉金橋，EK172428)，室溫封閉1小時。去掉封閉液，每個切片上加100-400 μl稀釋的一抗(1∶50,UCP4:A-5,SC-365295)。4℃孵育過夜。去掉抗體稀釋液。用漂洗液洗3次，每次5 min。每個切片加入過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗稀釋液(1∶500,博士德，BA1054，HRP Conjugate，China)，用漂洗液洗3次，每次5 min。加入100-400 μl DAB，觀察染色進展。一旦切片染色成功，立刻將玻片浸入水中。如有需要，將切片泡在蘇木精溶液中復染，按照產(chǎn)品說明進行。切片用蒸餾水洗兩次，每次5 min。切片脫水：在95%乙醇中孵育兩次，每次10 s。在100%乙醇中孵育兩次，每次10 s。在二甲苯中孵育兩次，每次10 s。加上蓋玻片。用Permount固定，并在顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)上評價(×200)。

1.7 Western Blot 實驗方案

提取蛋白：從液氮中取出100 mg大鼠的海馬組織，加入適量的RIPA buffer和PMSF，其中1 ml RIPA buffer加10 μl PMSF；組織勻漿：用剪刀將組織剪成小塊，用勻漿器(PRO 200手持式均質(zhì)勻漿器)在冰水中勻漿，直到?jīng)]有明顯的腦組織沉淀出現(xiàn)，4℃離心機13 000 rpm，8 min，離心兩次取上清，取10 μl樣品用BCA法測定蛋白濃度。其他分裝置于-80℃保存。通過SDS PAGE分離蛋白質(zhì)并轉移到PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉液(脫脂奶粉：TBST=0.5 g：10 ml)封閉PVDF膜，室溫水平搖床孵育2小時。一抗/二抗孵育，將封閉后的雜交膜，在搖床上用TBST洗膜3次×5 min，分別加入經(jīng)一抗稀釋液(碧云天)稀釋抗體(UCP4:A-5,SC-365295，1∶1000，Santa Cruz Biotechnology，USA);(Caveolin-1,1∶1000,Anti-Caveolin-1 antibody,ab36152,Abcam,USA)4℃平緩震蕩孵育過夜。之后，在搖床上用TBST洗膜3次×5 min。加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(1∶1000，A0208，碧云天,China)室溫平緩震蕩孵育2小時。在搖床上用TBST洗膜3次×5 min。ECL顯色，打開化學發(fā)光顯影系統(tǒng)，將配好的ECL發(fā)光液均勻的涂布于PVDF蛋白膜上，進行曝光顯影，圖像分析，測出灰度值。

1.8 微量法測定線粒體復合物Ⅲ活性

嚴格按照線粒體復合體Ⅲ試劑盒說明書(FHTC-1-Y 蘇州科銘銘生物技術有限公司)檢測。線粒體復合物Ⅲ的量：1)準確稱取 0.1 g組織或收集 500萬細胞，加入1 ml試劑一和10 μl試劑三，用冰浴勻漿；2)將勻漿 600 g，4℃離心5 min；3)棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11 000 g，4℃離心 10 min。上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅲ；步驟③中的沉淀即為線粒體，加入 200 μl試劑二和 2 μl試劑三，超聲波破碎(冰浴，功率 20%或 200W，超聲3 s，間隔10 s，重復30次；4)分光光度計或酶標儀預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至550 nm，蒸餾水調(diào)零；5)96 孔板中加入10 μl樣本、25 μl試劑六和200 μl工作液，立即混勻，記錄 550 nm 處初始吸光值A1和2 min 后的吸光值A2，計算 ΔA=A2-A1。

1.9 統(tǒng)計分析

使用雙向方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計分析，然后通過SPSS軟件(版本13.0)進行Student-Newman-Keuls事后檢驗。在95%置信水平下接受統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差。

2 結果

2.1 運動應激干預對D-半乳糖誘導衰老大鼠大腦認知障礙保護的作用

如圖1A所示，隨著訓練天數(shù)的增加，從各組大鼠尋找平臺的軌跡上可以明顯看出D組在尋找平臺時始終沿著平臺邊緣隨意的游動，沒有目的性。而DE與其他三組比較在尋找平臺的路徑上差異不顯著。如圖1B所示，在空間探索實驗中，D組與C組及DE組相比，平均穿越次數(shù)明顯減少(P<0.05)；E組與C及DE組相比平均穿越次數(shù)增加(P<0.05)。

圖1 運動應激對預防D-半乳糖誘導衰老大鼠認知功能障礙的作用

2.2 運動應激干預上調(diào)D-半乳糖誘導衰老大鼠海馬CA1區(qū)UCP4蛋白

為了研究運動應激干預與非運動干預D-半乳糖誘導的衰老大鼠海馬CA1區(qū)UCP4是否存在差異性表達，對D組及DE組進行了IHC(圖2棕褐色為UCP4蛋白表達)。用IPP (Image-Pro Plus 6.0)軟件對圖像進行處理得到光密度值(IOD)然后進行差異性分析，由圖2B可以看出DE組UCP4蛋白表達與D組相比較多，具有差異性(P<0.05)。

2.3 運動應激干預上調(diào)D-半乳糖誘導衰老實驗組大鼠海馬UCP4蛋白

實驗結果顯示(圖3)，D組大鼠海馬中UCP4蛋白表達最低，與C組相比具有顯著性差異(P<0.01),與DE組相比也具有差異性(P<0.05)；而E組與DE組相比，表現(xiàn)出了差異性(P<0.05),與對照組及其他組相比未見差異性。這與之前免疫組化中的結果吻合，說明運動應激后能夠上調(diào)大鼠海馬UCP4蛋白，UCP4位于線粒體的內(nèi)膜中，起到防止氧化應激的作用，運動應激能夠改善因衰老導致的氧化應激給大腦帶來的傷害。

圖3 各組大鼠海馬UCP4蛋白表達的結果

2.4 運動應激能夠抑制D-半乳糖誘導衰老大鼠海馬Caveolin-1蛋白的上調(diào)

在探索線粒體功能與UCP4蛋白表達的同時研究Caveolin-1在線粒體功能中的影響，Western Blot實驗表明，Caveolin-1在注射過D-半乳糖的組別中表達較高，C組Caveolin-1蛋白表達最少，而通過(圖4B)可以看出運動后Caveolin-1與對照組相比有所增加但未產(chǎn)生差異性。Caveolin-1在D-半乳糖注射組中表達最多，與對照組相比具有顯著的差異性(P<0.01)，與DE組相比也產(chǎn)生差異性(P<0.05);DE組與對照組相比具有差異性(P<0.05)。這表明運動應激能夠抑制因氧化應激所帶來Caveolin-1蛋白的上調(diào)。

圖4 各組大鼠海馬Caveolin-1蛋白表達的結果

2.5 運動應激干預提高D-半乳糖誘導衰老大鼠海馬線粒體復合物Ⅲ含量

如圖5中ELISA測試所示，運動干預組與對照組相比均具有差異性，其中E組具有顯著性差異性，這說明運動應激干預可以提高海馬線粒提復合物Ⅲ的含量。而D組與運動組相比線粒體復合物Ⅲ的量明顯低于運動組，具有差異性(P<0.05)。

圖5 運動應激干預提高D-半乳糖誘導衰老大鼠海馬線粒體復合物Ⅲ含量的影響

3 討論

研究表明，運動應激在衰老過程和幾種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展中起著重要作用。本研究揭示了運動應激對D-半乳糖注射大鼠衰老模型中海馬神經(jīng)UCP4蛋白和認知障礙的調(diào)節(jié)作用?？傮w而言，運動應激可以通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)UCP4蛋白的表達及Caveolin-1蛋白的表達來影響海馬線粒體功能，改善D-半乳糖誘導的全身氧化應激反應，學習記憶喪失和神經(jīng)元損傷。

當細胞被自由基攻擊時，Caveolin-1能維持線粒體的完整性和功能，促進線粒體定位[9]。在軟骨和內(nèi)皮細胞中氧化應激對Caveolin-1有上調(diào)作用[10]。線粒體UCP具有多種功能，所有這些功能都與它們在減少線粒體內(nèi)膜質(zhì)子梯度上的主要作用有關。這一行動的凈效應是減少ATP合成，減少鈣流入線粒體基質(zhì)，消散熱量，減少ROS產(chǎn)生[11]。

五種已知的UCP(UCP1-5)在組織分布和生理功能方面差異很大。UCP4的作用，幾乎完全局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，仍然不清楚，但我們的數(shù)據(jù)表明也可能發(fā)揮神經(jīng)保護作用，因為這些同種型的表達增加了線粒體復合物Ⅲ的活性，表明UCP4在D-半乳糖誘導的大鼠模型中增強了線粒體的功能。

在過去的幾十年中，已經(jīng)建立了多種動物模型用于研究衰老。通過長期施用D-半乳糖(100 mg·kg-1)可以通過實驗模擬自然衰老。D-半乳糖是一種還原糖，可以在生理濃度下代謝。長期給藥D半乳糖苷酶可導致酶的過載，這損害人體催化半乳糖轉化為葡萄糖的能力，并導致過氧化氫和其他自由基的累積。最近的研究表明，慢性系統(tǒng)性D-半乳糖暴露誘導小鼠記憶喪失，神經(jīng)變性，氧化損傷和炎癥反應。在我們的研究中，通過多次動物行為實驗，腹腔注射D-半乳糖減少了工作記憶喪失和參考記憶障礙，而沒有喪失運動活動。

在本研究中，我們確定了運動應激對大鼠海馬UCP4蛋白具有調(diào)控作用。在Morris水迷宮中潛伏期是一個很重要的指標，潛伏期時間的長短代表著各組實驗大鼠空間記憶的好壞，潛伏期時間短，說明在入水后尋找平臺的時間短，還能間接反應水中游泳速度以及入水后各組大鼠的反應，在實驗中正常大鼠入水后游泳速度快，D半乳糖干預組游泳速度慢，其入水后四處觀望，原地打圈。潛伏期時間長，預示著該組大鼠空間學習記憶能力差。結合水迷宮行為學的研究結果，我們可以推出，與衰老組對比運動應激干預增強了大鼠的學習記憶能力，同時上調(diào)了UCP4蛋白的表達，這說明UCP4蛋白對大鼠認知功能障礙具有一定的保護作用。

呼吸鏈功能下降直接會引起ATP合成量的下降，細胞所需能量不足，從而發(fā)生一系列的衰老表現(xiàn)，尤其是心、腦等以ATP為主要能源的代謝旺盛的器官，首先表現(xiàn)衰老[12]。另外呼吸鏈功能的下降可加速自由基的產(chǎn)生，線粒體復合物Ⅲ也被稱為輔酶Q-細胞色素C還原酶，其通過Q循環(huán)傳遞電子，是電子鏈傳遞過程中的關鍵復合物。但有實驗證明在沒有Caveolin-1的情況下，m-AAA無法定位于線粒體，這種保護機制喪失，導致呼吸鏈蛋白降解。UCP4也稱為腦線粒體載體蛋白，雖然UCP4在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用未證實，他們對減少氧化應激的功能是明確的。某些證據(jù)表明UCP4和線粒體復合物Ⅱ之間存在蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用：過表達UCP4的神經(jīng)母細胞瘤細胞通過增加由線粒體復合物Ⅱ介導的琥珀酸誘導的細胞呼吸來增加ATP合成[13]。但是否與線粒體復合物Ⅲ存在一定的聯(lián)系，需要進一步的研究。在本研究中我們證明了UCP4在腦神經(jīng)保護的作用，這也與之前Hoang 等人[14]推測UCP4在早期神經(jīng)元發(fā)育過程中起神經(jīng)保護作用相吻合。在AD患者的大腦中，UCP2,4和5的表達水平顯著降低，限制了細胞保護機制的激活[15]。

以前的研究表明，Caveolin-1的過表達可以破壞蛋白質(zhì)的正常運輸，因為它可以作為內(nèi)化的小寡聚體遞送到細胞表面，并被靶向溶酶體降解[16]。本實驗結果顯示在衰老組中Caveolin-1蛋白過量表達，這一結果說明可以把Caveolin-1作為評價衰老的一個靶點。但本研究可以看出在運動組(E)Caveolin-1的表達較對照組有所提高但并未產(chǎn)生差異性，這說明正常Caveolin-1的表達對神經(jīng)細胞具有保護作用，這與其在線粒體電子鏈傳遞過程中調(diào)節(jié)復合物活性有關。有實驗證明，在氧化應激后，缺乏Caveolin-1的細胞中線粒體蛋白酶活性降低。通過本實驗也可以看出雖然過表達可以加速大鼠衰老但適度的表達對衰老具有改善的作用。

總之，目前的研究提供證據(jù)表明，通過運動應激干預D-半乳糖誘導的衰老大鼠能改善認知學習功能，延緩其腦老化進程。這可能與線粒體UCP4表達上調(diào)，線粒體復合物Ⅲ活性增強以及對Caveolin-1的調(diào)控有關。因此，在今后預防老年腦衰老的過程中，加強對老年人運動應激的干預及把Caveolin-1作為檢查靶點，把UCP4作為治療靶點在分子水平延緩大腦的老化具有可行性。