李 偉，胡 縣，吳興宇*

(鄂州市中心醫(yī)院 1.耳鼻喉科；2.心胸外科，湖北 鄂州436000)

過去十年的流行病學(xué)趨勢表明，鼻咽癌的發(fā)病率逐漸下降，并且該疾病的死亡率也隨之大幅下降[1]。但是，對鼻咽癌發(fā)病機制的探索和新型藥物的開發(fā)并不能減緩，甚至忽視。如今，靶向自噬的促死亡和促存活功能已成為治療鼻咽癌的新型治療策略[2]。目前，已有多種藥物能夠誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞CNE2自噬性細胞死亡，包括次黃芩素和二芳基喹啉化合物STM-57[3]。miR-223-3p在多種腫瘤中高表達，包括鼻咽癌[4-5]。Yang W等人[6]發(fā)現(xiàn)miR-223-3p能夠抑制人鼻咽癌細胞的增殖。但是具體機制未明。ATG7是一種關(guān)鍵的自噬中間體，可促進自溶酶體形成、吞噬和清除受損線粒體的自噬作用[7]。本研究旨在探討miR-223-3p、ATG7與鼻咽癌細胞自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人鼻咽癌細胞CNE2購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號：ZQ0480)；ATG7，P62，LC3-Ⅱ和TUBULIN抗體購自ABCAM公司(貨號：ab133528，ab56416，ab48394，ab7291)；RPMI-1640培養(yǎng)基購自GE health公司(貨號：SH30091)；胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司(貨號：10099-133)；pMIR-Report Luciferase質(zhì)粒購自上海鈺博生物科技有限公司(貨號：YB-0536)；Luciferase熒光素酶報告檢測試劑盒購自艾美捷公司(貨號：K801-200)；PURELINK RNA MICRO KIT購自南京科佰生物科技有限公司(貨號：12183016)；miRNA反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒購自復(fù)能基因公司(貨號：QP015)；高效RNA轉(zhuǎn)染試劑購自上海康朗生物科技有限公司(貨號：KL-D5890)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG(H+L)和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L) 購自碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號：A0192，A0208)；ClonExpress II One Step Cloning試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號：C112-01/02)；U6熒光定量PCR引物購自復(fù)能基因公司(貨號：HmiRQP9001)；miR-223-3p熒光定量PCR試劑盒購自HaiGene公司(貨號：AP01461)；miR-223-3p序列來自miRBase，miR-223-3p mimics和miR-223-3p inhibitor由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人鼻咽癌細胞CNE2使用含 10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于潮濕的環(huán)境中(37℃，5%CO2)。使用高效RNA轉(zhuǎn)染試劑進行miR-223-3p mimics或miR-223-3p inhibitor的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時，收獲CNE2細胞并進行下游分析。

1.2.2RNA提取和RT-qPCR 根據(jù)試劑盒的說明書，用PURELINK RNA MICRO KIT提取RNA，miRNA反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄以及qPCR反應(yīng)。將所有樣品標(biāo)準化為人U6并表達為倍數(shù)誘導(dǎo)。所有反應(yīng)一式三份進行并重復(fù)三次。使用2-ΔΔct方法計算相對表達水平和SD。

1.2.3免疫印跡 將等量的蛋白質(zhì)(40 μg)在12%SDS-PAGE上電泳，并將條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜用5%脫脂奶粉在0.05M pH 7.4 Tris緩沖鹽水(TBS)中封閉3小時，并在4℃下與相應(yīng)抗體(ATG7，P62，LC3-Ⅱ和TUBULIN)一起孵育過夜。然后在TBST(TBS中的0.1%Tween-20)中將PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)洗滌3次，用時30 min，并與HRP綴合的抗體共同孵育2 h，該抗體為山羊抗小鼠IgA或山羊抗小鼠IgG。用3次TBST(Tris+HCL=Tween)改變洗滌30 min后，最終顯影用ECL發(fā)光液處理膜5 min，在室溫條件下。

1.2.4Luciferase assay 于培養(yǎng)板中接種A549細胞，該培養(yǎng)板為24孔洞型，每孔接種細胞數(shù)為5×104個。培養(yǎng)完整1天后，進行轉(zhuǎn)染細胞，混合200 ng/ml雙熒光素酶報告質(zhì)粒和40 nM miR-1254 mimics。在1天的轉(zhuǎn)染后，利用酶標(biāo)儀檢測熒光素酶的活性，通過Luciferase熒光素酶報告檢測試劑盒。進行的所有轉(zhuǎn)染均需反復(fù)操作大于等于3次以上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間差異應(yīng)用單因素方差分析。P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-223-3p靶向ATG7的3’UTR

利用TargetScan軟件進行在線分析，發(fā)現(xiàn)1處匹配度很高，位于miR-223-3p與TG7的3’UTR，分別處于ATG7 3’端非編碼區(qū)的2791-2798位置以及1583-1589位置。并且miR-223-3p與ATG7 3’端非編碼區(qū)的2791-2798位置結(jié)合較為保守。見圖1。將ATG7的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的2791-2798位置以及1583-1589位置分別克隆進PMIR-RB-REPORT熒光素酶報告載體，并命名為ATG7 3’UTR-1和ATG7 3’UTR-2。通過Luciferase assay，發(fā)現(xiàn)ATG7-3’UTR-1與ATG7 3’UTR-2組在過表達miR-223-3p時，基因活性較處理前顯著下降，該基因為熒光素酶報告基因，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見圖2。

圖1 miR-223-3p與ATG7的3’UTR匹配位置

圖2 miR-223-3p靶向ATG7的3’UTR

2.2 表達miR-223-3p時，ATG7的表達量下降

表達miR-223-3p后，用該引物進行PCR檢測，該微小RNA表達量顯著升高(P<0.05)。見圖3。免疫印跡發(fā)現(xiàn)，ATG7顯著下降(P<0.05)；P62顯著下降(P<0.05)，而LC3-Ⅱ亦顯著下降(P<0.05)，說明過表達miR-223-3p后，CNE2細胞自噬水平下降。見圖4。

圖3 過表達miR-223-3p

圖4 ATG7的表達量下降，細胞自噬標(biāo)志蛋白顯著變化

2.3 敲低miR-223-3p時，ATG7的表達量上升

敲低miR-223-3p后，用miR-223-3p的特異性引物進行實時熒光定量PCR，miR-223-3p的表達量明顯下降(P<0.05)。見圖5。免疫印跡發(fā)現(xiàn)，ATG7顯著上升(P<0.05)，P62顯著上升(P<0.05)，而LC3-Ⅱ顯著上升(P<0.05)，說明過表達miR-223-3p后，CNE2細胞自噬水平上升。見圖6。

圖5 敲低miR-223-3p

圖6 ATG7的表達量上升，細胞自噬標(biāo)志蛋白顯著變化

3 討論

2012年全世界報告了86500例鼻咽癌，僅占同年所有癌癥的0.5%[8-9]。71%的新病例位于亞洲東部和東南部，中南亞[10]。在人口方面，男性患病的可能性是女性的兩到三倍，疾病發(fā)病的高峰年齡在50到60歲之間[11]。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p在鼻咽癌腫瘤組織中高表達，能夠抑制人鼻咽癌細胞的增殖，但是其具體機制不明。本研究通過分析miR-223-3p、ATG7與鼻咽癌細胞自噬的關(guān)系，為治療鼻咽癌提供理論基礎(chǔ)。

ATG7作為巨自噬泛素系統(tǒng)中的核心蛋白，其在自噬和非自噬過程中有著重要的作用[12-13]。miR-223-3p是一種與鼻咽癌細胞周期和凋亡密切相關(guān)的miRNA分子，通過影響基因表達來調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡[14]。通過堿基與3’UTR結(jié)合，miRNA可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p靶向ATG7的3’UTR的2791-2798以及1583-1589位置，并且miR-223-3p與1583-1589位置的結(jié)合效率更高。最新的研究亦發(fā)現(xiàn)miR-223-3p影響各種癌細胞的生物學(xué)進展，并在結(jié)直腸癌細胞中顯示出致癌作用[16]。本研究中，過表達miR-223-3p時，ATG7量下降(P<0.05)，而敲低miR-223-3p后，ATG7量明顯上升(P<0.05)。ATG7為胱天蛋白酶-8抑制誘導(dǎo)的自噬死亡所必需的分子。Gong C[17]等發(fā)現(xiàn)沉默ATG7基因表達后，能夠抑制DTX誘導(dǎo)的自噬。推測細胞中存在miR-223-3p-ATG7-DTX的通路調(diào)控細胞自噬，并且受蛋白或核酸分子影響。在本研究中發(fā)現(xiàn)，ATG7量與細胞自噬相關(guān)蛋白P62和LC3-Ⅱ量明顯下降(P<0.05)；ATG7量上升后，細胞自噬相關(guān)蛋白P62和LC3-Ⅱ量明顯上升(P<0.05)。P62和LC3-Ⅱ作為自噬的標(biāo)志性蛋白，在自噬體形成中發(fā)揮重要作用，表達量的上升表明自噬水平的上升，當(dāng)ATG7 表達上調(diào)后可促進 P62、LC3-Ⅱ的降解[18-19]。

目前，自噬可影響藥物敏感性，因此可以作為殺死腫瘤細胞的機制。miR-223-3p能夠靶向ATG7 3’UTR的2791-2798和1583-1589位置，并且抑制人鼻咽癌細胞CNE2自噬?；诖耍狙芯堪l(fā)現(xiàn)的miR-223-3p調(diào)控ATG7表達水平的機制可作為腫瘤藥物開發(fā)的一個新方向。然而本研究并未對其機制進一步研究，后續(xù)實驗需進行深入分析，為鼻咽癌細胞自噬理論進行補充。