姜洪偉，胡 琦*，王 舉，白鈺靈,套格蘇，李海軍，胡錦峰

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 胃腸外科,內(nèi)蒙古 呼和浩特010017；2.內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗醫(yī)院 普外科；3.內(nèi)蒙古赤峰市醫(yī)院 肛腸外科)

我國胃癌(GC)發(fā)病數(shù)占全球的42.6%，死亡數(shù)占全球胃癌的45.0%,在全球所有的國家中居發(fā)病率第5位、死亡率第6位[1]。細胞外基質(zhì)(ECM)具有多種功能——它為干細胞創(chuàng)造了一個生態(tài)區(qū)域，包括調(diào)節(jié)細胞間化學(xué)和機械信號網(wǎng)絡(luò)，血管生成，先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，以及細胞的遷移和侵襲[2-3]。ECM成為癌癥進展和治療反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，能夠調(diào)節(jié)癌癥的基本特征[4]。膠原蛋白是ECM的重要組分，COL3A1基因編碼Ⅲ型膠原α-1鏈。A J d’Ardenne 等人[5]早在1984年就對不同良惡性腫瘤中COL3A1的表達進行了免疫組化染色，結(jié)果顯示其在所有的腫瘤標本中均為陽性染色；良性腫瘤中以平滑肌瘤、肌腱鞘巨細胞瘤Ⅲ型膠原表達量最高，惡性腫瘤中以平滑肌肉瘤、纖維肉瘤膠原表達量最高。Hongyu Shen等[6]利用在線生物信息軟件預(yù)測胃癌中表達上調(diào)的基因及其上游miRNAs，并進行生存分析，發(fā)現(xiàn)COL3A1在胃癌中表達上調(diào)，并且可以預(yù)測胃癌的預(yù)后。本課題組前期采用實時定量PCR法(qRT-PC)及免疫組化法檢測胃癌及其正常組織中COL3A1的mRNA及蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中COL3A1的mRNA及蛋白表達水平均顯著高于正常組織。本研究采用靶向COL3A1的干擾慢病毒(3個靶點)及陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細胞株MGC803，嘌呤霉素抗性篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，qRT-PCR法及Western blot法篩選出轉(zhuǎn)染效率高的胃癌細胞株，進行后續(xù)MTT及Transwell實驗，進一步探討COL3Al在胃癌增殖、侵襲及遷移中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器MGC803 細胞(北京 Biobw，bio-81816)、青霉素-鏈霉素溶液(武漢普諾賽，PB180120)、RPMI-1640 培養(yǎng)基(武漢普諾賽，PM150110/500 ml)、0.25%胰酶(美國 Hyclone，SH30042.01/100 ml)、COL3A1 基因敲除慢病毒(上海吉凱基因)、MTT(上海 Biosharp，5 g)、4%多聚甲醛(上海碧云天，P0099-100 ml)、1%結(jié)晶紫染色液(北京索萊寶，G1062)、Matrigel 基質(zhì)膠(美國BD Biocoat，356234)、PVDF膜(Millipore，ISEQ00010)、ECL發(fā)光液(Tanon，180-5001)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime，P0010)、熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems，ABI-7500)、微量分光光度計(美國ThermoFisher，Nanodrop 2000)、SDS-PAGE電泳儀(Bio-Rad，Mini Protean 3)、濕法轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，170-3930)、脫色搖床(金壇市醫(yī)療儀器，TY-80R)、化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Tanon，5200)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) MGC803細胞在含有10%胎牛血清和100 U/ml青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 (1)嘌呤霉素濃度篩選：濃度分別為0、0.5、1、2、3、4、5 μg/ml，培養(yǎng)1周。調(diào)整濃度為5×104cells/ml后加入有促轉(zhuǎn)染劑polybrene(8 μg/ml)新鮮培養(yǎng)基，配置懸液，計算公式：病毒體積=(MOI×細胞數(shù)目)/病毒滴度。加入嘌呤霉素后觀察熒光蛋白表達。

1.2.3qRT-PCR法 根據(jù)TAKARA PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser試劑盒的標準操作步驟進行，提取 total RNA，3%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計測定RNA濃度和純度,A260/A280比值在1.8-2.0之間。反轉(zhuǎn)錄后以 cDNA 為模板進行熒光定量 PCR。COL3A1引物序列：正向TTGAAGGAGGATGTTCCCATCT，反向ACAGACACATATTTGGCATGGTT。GAP

DH引物序列：正向GAGTCAACGGATTTGGTCGT，反向TTGATTTTGGAGGGATCTCG。反應(yīng)體系為cDNA 2 μl、PCR 上游引物 0.4 μl、PCR 下游引物 0.4 μl、SYBR Green solution 10 μl、滅菌雙蒸水 7.2 μl。每個樣品mRNA相對表達量通過計算其各自的Ct值計算得出。

1.2.4Western blot法 培養(yǎng)基PBS洗滌，1000轉(zhuǎn)離心 5 min，將細胞濃度調(diào)整為3×104cells/ml。接種于培養(yǎng)板培育48 h。PBS洗滌后，0.2 ml/孔加入裂解液，置入-80℃超低溫冰箱中。離心后留下細胞上清液，-20℃下保存。配置BCA工作液：按照0、1、2、4、8、12、16、20 μl的濃度量加入96孔中。加入BCA工作液孵育。測定吸光度值。清洗玻璃板后灌膠，80V電泳30 min，樣品進入分離膠后，改120V電泳90 min。電流320 mA開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用1×麗春紅染液染膜5 min。浸泡TBS后,轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉、TBST溶液的平皿中,脫色搖床封閉。TBST稀釋一抗，4℃孵育，脫色搖床清洗10 min，重復(fù)3次。二抗的孵育首先使用TBST溶液1∶5000稀釋，然后孵育2h，脫色三次。用Tanon ECL作為發(fā)光試劑，Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像儀拍照，留下拍照后圖片。

1.2.5MTT實驗 培養(yǎng)基終止消化后離心5 min。倒掉上清，加入3 ml培養(yǎng)基重懸細胞。胰酶消化細胞，離心后去上清，重懸細胞。細胞接種在6孔板中，每孔1×106個細胞，接種后培養(yǎng)12 h貼壁。敲減COL3A1處理下，細胞培養(yǎng)至設(shè)定時間(0、12、24、48 h)后，每孔分別加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h后去除，加入150 μl DMSO搖勻。吸光值用酶標儀進行測定，波長570 nm，根據(jù)吸光值和時間繪制生長曲線。

1.2.6細胞遷移實驗 PBS洗滌后胰酶消化，放入新培養(yǎng)基計數(shù)。10% FBS的培養(yǎng)液加入孔板，使細胞濃度為(5×105/ml)，Transwell小室加入100 μl 懸液并放培養(yǎng)24 h。取出小室，吸凈培養(yǎng)液后清理掉上層細胞，PBS洗滌，甲醇固定。PBS洗滌三次，擦干后使用1%結(jié)晶紫染液染色后PBS清洗3次，常溫倒置晾干。顯微鏡下(200倍)拍照并計算各視野中穿膜細胞的平均數(shù)。

1.2.7細胞侵襲實驗 將無血清培養(yǎng)基與預(yù)冷的Matrigel基質(zhì)膠9∶1混勻。

將上步Matrigel基質(zhì)膠100 μl加入Transwell小室，然后放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，等待基質(zhì)膠凝固。其余實驗步驟同遷移實驗相同。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析實驗所得數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，每組實驗至少重復(fù)三次，數(shù)據(jù)處理軟件為GraphPad Prism 6，兩組樣本均值之間的比較采用t檢驗，多組樣本均值之間的比較采用ANOVA檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)MGC803胃癌細胞株，發(fā)現(xiàn)正常的MGC803細胞多為梭形或多角形，也有部分為圓形。呈單核、單層貼壁生長的特點(圖1)。

圖1 光鏡下 MGC803 細胞形態(tài)觀察(200 倍)

2.2 MGC803細胞轉(zhuǎn)染

靶向COL3A1的干擾慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，倒置熒光顯微鏡下可見COL3A1 shRNA慢病毒成功轉(zhuǎn)染到MGC803細胞內(nèi)(圖2)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的干擾組及對照組細胞株分別分為陰性對照組(NC組)、shRNA 1組、shRNA 2組和shRNA 3組，未轉(zhuǎn)染慢病毒的細胞株為空白對照組(Control組)。

圖2 轉(zhuǎn)染后細胞熒光攜帶情況

用qRT-PCR和Western blot法篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的細胞株，qRT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染shRNA-COL3A1慢病毒后，COL3A1的mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05)；與NC組相比，COL3A1在shRNA 1組、shRNA 2組、shRNA 3組的mRNA表達同樣顯著下降，而NC組與Control組相比細胞的mRNA表達無明顯變化(P>0.05)，在這三組中抑制效果最好的是shRNA 1組(P<0.01)、shRNA 3組(P<0.001)(圖3)。選擇shRNA 1組和shRNA 3組進行后續(xù)實驗，后續(xù)實驗中shRNA 1組及shRNA 2組為該步中的shRNA 1組和shRNA 3組。重新分組后進行Western Blot實驗，結(jié)果表明，shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后,胃癌細胞中COL3A1的蛋白表達水平均顯著降低，其中shRNA 2組抑制效果更顯著(P<0.01)(圖4)，這與PCR的結(jié)果一致。

圖3 shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后COL3A1 mRNA表達水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs.Control；##P<0.01，### P<0.001vs.NC)

A：WB曝光條帶；B：COL3A1的蛋白表達水平

2.3 MGC803 MTT

轉(zhuǎn)染后各組細胞增殖能力通過MTT法檢測(表1)，通過繪制不同時間點的光吸收值得到生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后，胃癌細胞的生長在48 h內(nèi)受到明顯抑制，在各時間點OD值均低于NC組(P<0.05)，其中shRNA 2組抑制效果最為顯著(P<0.0001)(圖5)。

表1 敲減COL3A1后各組MGC803細胞平均吸光值(OD值：Mean±SD)

圖5 shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后48 h內(nèi)胃癌細胞增殖情況 (*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001 vs NC，n=3)

2.4 MGC803細胞遷徙

通過Transwell小室檢測細胞遷移情況，計數(shù)膜下細胞數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后，shRNA 1組(P=0.0029)及shRNA 2組(P<0.0001)胃癌細胞的遷移能力顯著降低，其中以shRNA 2組最為顯著(P<0.0001)(圖6)。

A：顯微鏡下穿膜細胞觀察(200 倍)；B：各組穿膜細胞數(shù)量統(tǒng)計

2.5 MGC803細胞侵襲

通過Transwell小室(加Matrigel基質(zhì)膠)檢測細胞侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA-COL3A1 轉(zhuǎn)染后，shRNA 1組(P=0.0046)及shRNA 2組(P=0.0002)胃癌細胞的侵襲能力均顯著降低，其中同樣以shRNA 2組最為顯著(P<0.001)(圖7)。

A：顯微鏡下穿膜細胞觀察(200倍)；B：各組穿膜細胞數(shù)量統(tǒng)計

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，為了進一步探究COL3A1與胃癌的關(guān)系，本研究通過COL3A1敲減的慢病毒轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株BGC-803，并檢測經(jīng)處理后胃癌細胞的遷徙及侵襲能力，結(jié)果顯示敲減COL3Al能抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲，說明COL3Al可能是胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的重要角色。推測這是由于COL3A1表達降低后胃癌細胞周圍膠原網(wǎng)絡(luò)剛度下降所致。細胞外基質(zhì)硬化導(dǎo)致的細胞內(nèi)收縮可引起肌動蛋白硬度和細胞遷移增加[7]。腫瘤硬度增加可能在幾個方面調(diào)節(jié)腫瘤進展。例如增加基質(zhì)剛度會增加細胞骨架張力，以促進粘連聚集，并增加生長因子依賴性的胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)[8]。此外，基質(zhì)剛度促進整合素聚類，導(dǎo)致黏著斑激酶1(FAK1)的激活，進而激活ERK通路，引起細胞遷移、侵襲和增殖[9]。小鼠腫瘤模型中FAK1的缺失抑制了腫瘤細胞的局部侵襲和轉(zhuǎn)移，這表明FAK1的激活可能是引起腫瘤ECM剛度增加、促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)[10]。王頡[11]等發(fā)現(xiàn)COL3A1可以通過蛋白激酶B(PKB) /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路發(fā)揮促結(jié)腸癌腫瘤生長的作用。Wang Xiao-Qing[12]等同樣發(fā)現(xiàn)COL3A1在結(jié)直腸癌中存在過表達，并且是影響預(yù)后的危險因素，COL3A1還可以通過刺激磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-AKT信號通路促進結(jié)腸癌細胞增殖。Becky[13]等學(xué)者通過體外動物實驗發(fā)現(xiàn)當COL3A1缺乏后，乳腺癌的黏附、侵襲和遷移均被抑制，癌細胞的增殖能力增強。而艾爾肯·肉孜比拉力[14]等的研究結(jié)果則不同，她們發(fā)現(xiàn)COL3A1在宮頸癌中為低表達，且人乳頭狀瘤病毒(HPV)陰性的宮頸癌細胞COL3A1的表達水平更高，過表達COL3A1后的宮頸癌細胞遷徙能力下降，這提示 COL3A1 在不同腫瘤中可能存在不同的功能。引起這種不同結(jié)果的原因可能是ECM與腫瘤細胞間復(fù)雜的動態(tài)變化所致。

綜上所述，COL3A1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，這為探究微環(huán)境與腫瘤細胞之間的相互作用提供了新的思路。但是COL3A1與胃癌的關(guān)系還是有待進一步的深入研究。本研究因客觀原因仍存在很多不足，如未檢測COL3A1在不同胃癌細胞系中的基礎(chǔ)表達情況，也未構(gòu)建COL3A1過表達細胞系對其在胃癌增殖、轉(zhuǎn)移中的作用進一步作證，這也是我們下一步的研究方向。