孫勝君，張昌蓮，趙自云

(1.煙臺市煙臺山醫(yī)院 檢驗科，山東 煙臺264000;2.山東省榮成市人民醫(yī)院 輸血科，山東 榮成264300;3.青島市中心醫(yī)院 檢驗科，山東 青島266042)

肺炎克雷伯菌(KP)是醫(yī)院內僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌[1]，可引起肺炎、腦膜炎、敗血癥等疾病。碳青霉烯類藥物由于具有較廣且較強的抗菌活性，已成為治療重癥感染的最后一道防線藥物。但隨著碳青霉烯類藥物在臨床的長期使用，碳青霉烯耐藥腸桿菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)尤其是碳青霉烯耐藥KP(Carbapenem-resistantK.pneumoniae,CRKP)已在全球多個國家出現(xiàn)[2-3]。在我國，KP對碳青霉烯類藥物的耐藥率約為11%[1]。KP對碳青霉烯類藥物耐藥主要是由產KPC-2型碳青霉烯酶引起的。近年來，產NDM型金屬酶的CRKP菌株開始呈現(xiàn)[3]。由于細菌耐藥具有地域性，不同地域細菌的耐藥性不同，所攜帶的碳青霉烯耐藥基因可能也不同，不同組織樣本細菌的耐藥等特性也不盡相同。隨著臨床中CRKP檢出率的升高，了解本地區(qū)CRKP的耐藥譜和耐藥基因型等特性，可指導臨床醫(yī)生正確選擇抗菌藥物減少抗菌藥物的濫用，也可減少多重耐藥CRKP的出現(xiàn)，降低醫(yī)院內獲得性感染的發(fā)病率和死亡率。為了解本地區(qū)不同組織來源CRKP菌株的耐藥情況和流行特征，本研究對臨床分離的CRKP耐藥表型進行總結分析，并檢測了菌株的碳青霉烯耐藥機制和分子分型，為臨床抗感染治療提供流行病學資料。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2017年5月至2021年4月部分住院患者痰液、尿液和血液感染性標本，剔除同一患者的重復菌株。

1.2 細菌鑒定及藥敏試驗

參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行細菌的分離、培養(yǎng)，菌株鑒定和藥敏試驗采用VITEK-2compact全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進行測定，共獲得了55株CRKP。測定了CRKP菌株對18種抗菌藥物的敏感性，其中頭孢哌酮采用紙片法進行測定，藥敏結果按文獻[4]進行判讀，替加環(huán)素耐藥折點參照歐洲藥敏試驗委員會2017年版標準(http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/)。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3 碳青霉烯耐藥基因檢測

通過水煮法提取CRKP菌株的DNA,保存于-20℃?zhèn)溆?，根據碳青霉烯酶及金屬酶相關基因(blaKPC-2，blaIMP，blaSPM，blaAIM，blaVIM，blaOXA，blaGIM，blaBIC，blaSIM，blaNDM和blaDIM)引物序列及PCR反應體系對CRKP菌株進行PCR檢測，擴增條件為95℃預變性5 min,(95℃,30 s+52℃,40 s+72℃,50 s)×35個循環(huán)，72℃再延伸5 min。擴增產物在100V電壓下用2%瓊脂糖電泳1小時。經電泳鑒定的PCR 產物送至青島派森諾基因科技有限公司測序，測序結果提交NCBI進行blast序列比對確認目的基因。

1.4 CRKP的MLST分析

在55株CRKP菌株中，隨機挑選27株進行多位點序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)，分析CRKP菌株的親緣關系和流行亞型，即對KP的7個管家基因rpoB，gapA，mdh，pgi，phoE，infB和tonB進行PCR檢測[5]。PCR產物送青島派森諾基因科技有限公司測序，7個管家基因序列分別提交至Institute Pasteur’s MLST數(shù)據庫 (https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef&page=sequenceQuery)確認菌株的MLST亞型。

1.5 統(tǒng)計方法

使用Excel對數(shù)據進行錄入，采用SPSS 17.0軟件，計數(shù)資料用(百分率)表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 菌株來源

2017年5月至2021年4月收集的CRKP菌株剔除重復后共獲得菌株55株，其中來自尿液標本14株，占25.5%，痰液標本31株，占56.4%，血液標本10株，占18.2%。

2.2 CRKP菌株藥敏試驗結果

55株CRKP菌株對亞胺培南和美羅培南兩種碳青霉烯類藥物均耐藥。從表1可以看出，CRKP對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟和氨曲南9種β-內酰胺類藥物或β-內酰胺類-酶抑制劑的耐藥率均達到98.2%。在氨基糖苷類藥物中，CRKP對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別為54.5%和74.5%。在氟喹諾酮類藥物中，CRKP對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均高于74.5%以上，受試菌株對復方新諾明的耐藥率也達到了69.1%。55株CRKP中并未發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素和多黏菌素耐藥的菌株。

分別來自尿液、痰液和血液的CRKP對包括碳青霉烯類藥物在內的11種β-內酰胺類藥物的耐藥率均在96.8%以上，且這11種β-內酰胺類藥物的耐藥率在三種來源CRKP中并無顯著性差異。此外，三種來源CRKP對氨基糖苷類藥物、環(huán)丙沙星、復方新諾明、替加環(huán)素和多黏菌素6種藥物的耐藥率也無顯著性差異。值得注意的是，血液來源CRKP對左氧氟沙星的耐藥率已達100%，且顯著高于痰液CRKP的耐藥率61.3%(P<0.05)，而與尿液CRKP對左氧氟沙星的耐藥率85.7%并無顯著性差異(表1)。

表1 不同標本來源CRKP菌株的耐藥率結果

在55株CRKP中，有多達45株(81.8%)表現(xiàn)為多重耐藥，且以β內酰胺類-氨基糖苷類-氟喹諾酮類-復方新諾明四重耐藥(45.5%)和β內酰胺類-氨基糖苷類-氟喹諾酮類三重耐藥(27.3%)表型最為流行(表2)。55株CRKP中只有2株菌僅對β-內酰胺類藥物耐藥。

表2 CRKP菌株的多重耐藥情況

2.3 碳青霉烯耐藥基因及分子分型

55株CRKP菌株全部攜帶碳青霉烯耐藥基因，其中blaKPC-250株(90.9%)最為流行,5株菌中檢測到blaNDM，并未發(fā)現(xiàn)同時攜帶blaKPC-2和blaNDM的菌株，也并未發(fā)現(xiàn)其他碳青霉烯耐藥基因。blaKPC-2在痰液、尿液和血液CRKP中均是流行基因型，blaNDM只在尿液和痰液CRKP中有檢出且痰液CRKP菌株中blaNDM的流行率達12.9%(表3)。

表3 不同樣本類型CRKP中碳青霉烯耐藥基因攜帶率

在隨機挑選的27株CRKP中，有25株已確定MLST型，共獲得10種不同的亞型。在確認的10種MLST亞型中，ST11、ST23和ST15型最為流行，檢出率分別為22.2%、22.2%和14.8%。ST1083、ST35、ST17、ST2004和ST432檢出率較低，分別只在一株菌中檢出(表4)。

表4 27株CRKP菌株中各MLST亞型分布

3 討論

目前，細菌感染的檢測是臨床微生物實驗室中很重要的工作，細菌培養(yǎng)和藥敏試驗結果對指導臨床抗感染治療至關重要。本文研究了55株CRKP的藥敏及耐藥特征，該55株CRKP菌株對包括碳青霉烯類和頭孢菌素類藥物在內β-內酰胺類藥物均耐藥，這對全部β-內酰胺類藥物在臨床中的應用構成了極大的威脅。菌株對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥率均高于70%以上，這嚴重影響了氟喹諾酮類藥物在CRKP感染中的治療作用，菌株對氟喹諾酮類藥物的高耐藥率可能與該類藥物在臨床中的長期使用引起喹諾酮耐藥決定區(qū)的突變有關[6]。本研究中CRKP菌株對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別高于54.5%和74.5%，這可能與菌株產生鈍化酶有關。多黏菌素和替加環(huán)素是治療革蘭陰性菌引起感染的最后防線藥物[7]，本研究中CRKP菌株對多黏菌素和替加環(huán)素均100%敏感，因此，在治療CRKP引起的感染中可選用這兩種藥物進行治療。

本研究在55株CRKP菌株中全部檢測到碳青霉烯耐藥基因，其中KPC-2型和NDM型酶是本地區(qū)CRKP的主要碳青霉烯酶，這與我國其他地區(qū)腸桿菌對碳青霉烯耐藥的研究結果類似[3]。但這一結果與歐洲國家CRE中碳青霉烯酶的流行情況不同，在歐洲國家中只有71%的CRE菌株攜帶碳青霉烯酶[8]。本研究中CRKP的MLST型呈現(xiàn)多樣性，但以ST11型和ST23型為CRKP的主要亞型，ST11型CRKP也是目前全球包括我國在內的主要流行亞型[3]，但ST23型在我國有增多的趨勢，也成為某些地區(qū)CRKP的主要亞型[3]。

綜上所述，臨床標本中分離的CRKP耐藥嚴重，常表現(xiàn)為多重耐藥，其對碳青霉烯耐藥主要是由KPC-2酶引起的。但近年來NDM型酶也逐漸增多，同時，CRKP的MLST型呈現(xiàn)多樣性。因此，我們要密切關注KP的耐藥表型和基因型的變化，多為臨床抗感染提供有價值的信息，共同應對細菌性感染性疾病的挑戰(zhàn)。