王 瑤，徐春暉，杜俊民

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619）

身體疲勞是指身體因過度運(yùn)動而無法維持一定的生理水平或規(guī)定的運(yùn)動強(qiáng)度的狀態(tài)[1]。目前有關(guān)身體疲勞原因的解釋、能量衰竭和自由基積累相關(guān)問題備受關(guān)注。近幾十年來，健康學(xué)者和運(yùn)動生理學(xué)家越來越關(guān)注尋求天然的抗疲勞療法。目前，功能性飲料已經(jīng)成了現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)，一些傳統(tǒng)中草藥（如刺五加）不僅能提高人類的運(yùn)動能力，加速消除疲勞，而且副作用很小[2-3]。

歐李（Cerasushumilis（Bge）Sok.）為灌木類野生果樹，屬薔薇科櫻桃屬[4]，為我國所特有的第三代小型水果，具有藥食兩用特性，因其富含有機(jī)酸[5]、多酚類[6]、氨基酸[6]、多肽[6]等成分，具有抗氧化、抗疲勞、抗焦慮和降血壓等功效，被廣泛用于保健食品[7]。

山楂（CrataeguspinnatifidaBge.）為薔薇科落葉灌木或小喬木植物果實(shí)[8]。其主要有效成分有黃酮類、有機(jī)酸類、三萜類化合物等[9]，所含糖分易被人體吸收，與有機(jī)酸相配合具有抗疲勞作用。

沙棘（HippophaerhamnoidesL.）屬于胡頹子科沙棘屬的一類多年生落葉灌木或小喬木[10]，是一種具有極高利用價值的藥食同源植物[11]。沙棘果中含有多種生物活性成分，具有良好的抗氧化、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等功能[12]，在保健食品、醫(yī)療等領(lǐng)域具有重要的開發(fā)價值。

已有報道表明，歐李具有一定的抗疲勞作用，在歐李中加入富含抗氧化成分的山楂和沙棘，一方面可以通過兩種特色果汁的自身物性改善歐李飲料的感官品質(zhì)，另一方面還可能增強(qiáng)歐李中原有的活性成分如花青素、γ-氨基丁酸、鈣等的活性，協(xié)同飲料的抗氧化作用，達(dá)到良好的抗疲勞效果[13]。本試驗(yàn)以歐李、山楂和沙棘為主要原料，研制一種復(fù)合飲料，并研究其對小鼠的抗疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

SPF級健康雄性小鼠（3周齡，19～21 g）50只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

歐李，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)鈣果研究組提供；山楂、沙棘，山西呂梁市售；蔗糖，市售；VC，購于河南圣斯德實(shí)業(yè)有限公司；果膠酶（10 000 U/mL），購于夏盛酶生物有限公司；黃原膠，購于河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；糖原測定試劑盒、乳酸（BLA）測試盒、血尿素氮（BUN）測試盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒和丙二醛（MDA）測試盒，購于南京建成生物工程研究所；試驗(yàn)用水為蒸餾水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備JYL-Y912破壁機(jī)，九陽股份有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-260恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；TFC-203PCA型智能土肥養(yǎng)份綜合測試儀，北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；T2600紫外可見分光光度計，上海祐科儀器表有限公司；BIOBASE-EL10系列自動酶標(biāo)儀，濟(jì)南濟(jì)威醫(yī)療器械有限公司；800-1離心機(jī)，惠智儀誠（北京）科技發(fā)展有限公司；XK96-A快速混勻器，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 歐李汁的制備

稱取新鮮歐李果1 kg，清洗、去核、破碎、過濾，加入20 mg/L 0.5%果膠酶，24 h常溫靜置澄清，再加入0.5 g/LVC增加穩(wěn)定性。

1.2.2.2 山楂汁的制備

稱取新鮮山楂100 g，洗清、去核、切碎，將果肉放入500 mL燒杯中，按液料比3∶1（mL/g）加水浸取山楂汁，在85℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，取出燒杯并用保鮮膜密封，靜置24 h后，過濾，將過濾液在65℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原來體積的1/2。

需注意不宜把山楂充分破碎，因?yàn)闈{狀山楂不利于后續(xù)的軟化和浸取。

1.2.2.3 沙棘汁的制備

稱取新鮮沙棘100 g，清洗，破碎，過濾，按0.03～0.06g/kg的比例加入果膠酶，常溫靜置24h，取上清液。

1.2.2.4 調(diào)配

歐李汁、沙棘汁、山楂汁、蔗糖以一定比例混合成原料液后，加入復(fù)合穩(wěn)定劑黃原膠進(jìn)行調(diào)配。

1.2.2.5 均質(zhì)、灌裝與滅菌

成品料液在60℃，25 MPa條件下均質(zhì)10 min后灌裝，90～95℃滅菌15～20 min，冷卻得歐李山楂沙棘復(fù)合飲料。

1.2.3 復(fù)合飲料感官評價

邀請10名飲料評價人員，對不同配方制得的歐李山楂沙棘復(fù)合飲料的色澤、香氣與滋味、組織狀態(tài)3方面進(jìn)行評分，總計40分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 復(fù)合飲料感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation of the compound beverage

1.2.4 復(fù)合飲料配方優(yōu)化

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計

在山楂汁添加量20%，沙棘汁添加量0.5%，蔗糖添加量12 g/L的條件下，考察歐李汁添加量（20%、30%、40%、50%、60%）對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響；在歐李汁添加量40%，沙棘汁添加量0.5%，蔗糖添加量12 g/L的條件下，考察山楂汁添加量（5%、10%、15%、20%、25%）對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響；在歐李汁添加量40%、山楂汁添加量15%、蔗糖添加量12 g/L的條件下，考察沙棘汁添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響；在歐李汁添加量40%，山楂汁添加量15%，沙棘汁添加量1.5%的條件下，考察蔗糖添加量（12、13、14、15、16 g/L）對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響。

1.2.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以歐李汁添加量（A）、山楂汁添加量（B）、沙棘汁添加量（C）和蔗糖添加量（D）為影響因素，以飲料的感官評分（Y）為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計，正交試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factorsand levelsof orthogonal test formula

1.2.5 動物試驗(yàn)

1.2.5.1 小鼠分組與劑量設(shè)計

50只健康雄性小鼠，自由攝食維持飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)（飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25℃，相對濕度為50%～70%）7 d后，根據(jù)體重隨機(jī)分為4組，即對照組及低、中、高劑量組，每組10只小鼠。低、中、高劑量組小鼠每日灌胃最佳配方制備的歐李山楂沙棘復(fù)合飲料量分別為0.10、0.20、0.3 mL/10gBW，對照組按0.2mL/10g BW給予生理鹽水，全部動物每天灌胃1次，連續(xù)灌胃20 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[14-15]。

1.2.5.2 負(fù)重游泳試驗(yàn)

末次灌胃30 min后，各組小鼠于鼠尾負(fù)重5%體重鉛皮，于（27±1.0）℃游泳池內(nèi)開展負(fù)重游泳試驗(yàn)，當(dāng)小鼠在7 s后不能浮出水面呼吸時，則被認(rèn)為已力竭[16]。

1.2.5.3 體內(nèi)生化指標(biāo)檢測

末次灌胃結(jié)束后，各組剩余小鼠自由游泳30 min，取出擦凈，于眼球取血，離心，取血清，于4℃保存血清，按照相關(guān)試劑盒說明書要求，檢測各組小鼠血清中BLA與BUN的含量[17]；取血后，將小鼠脫臼處死，取出肝臟，生理鹽水洗清，濾紙擦干，用小鼠肝臟和生理鹽水按照1∶9（g/mL）比例制成10%的肝臟組織勻漿液，離心，取上清液，備用。按照相關(guān)試劑盒使用說明，檢測各組小鼠SOD活性、GSH活性、MDA含量及肝糖原（HG）含量[18-20]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及方差分析，Graphpad Prism6軟件繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 歐李汁添加量對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響

由圖1可知，歐李汁添加量較低時，飲料口感酸澀，有分層現(xiàn)象，且歐李的香氣被掩蓋；當(dāng)歐李汁添加量在40%～60%時，飲料呈紅色，無分層現(xiàn)象，有歐李獨(dú)特的風(fēng)味?？紤]到節(jié)約成本，選擇歐李汁添加量30%、40%、50%進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖1 歐李汁添加量對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of Cerasushumilis juice addition on sensory of compound beverage

2.1.2 山楂汁添加量對歐李山楂沙棘復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響

由圖2可知，當(dāng)山楂汁添加量為15%時，感官評分最高，此時飲料口感協(xié)調(diào)，有歐李獨(dú)特的風(fēng)味，當(dāng)添加量增加時，飲料口感酸澀，歐李的香氣被掩蓋。因此，選擇山楂汁添加量10%、15%、20%進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖2 山楂汁添加量對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of hawthorn juice addition on sensory evaluation of compound beverages

2.1.3 沙棘汁添加量對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著沙棘汁添加量的增加，感官評分先升高后降低，添加量為1.5%時達(dá)到最高。因此，選擇沙棘汁添加量1.0%、1.5%、2.0%進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖3 沙棘汁添加量對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of Hippophae rhamnoides juice addition on sensory of compound beverage

2.1.4 蔗糖添加量對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著蔗糖添加量的增加，飲料的感官評分先升高后降低，這是由于蔗糖添加量過少，溶液口感偏酸，并且香氣混雜；而添加量過多又造成飲料酸甜失調(diào)。因此，選擇蔗糖添加量13、14、15 g/L進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖4 蔗糖添加量對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of sucrose addition on sensory of compound beverage

2.2 歐李山楂沙棘復(fù)合飲料配方正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

以飲料的感官評分（Y）為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。由表3可知，各因素對歐李山楂沙棘復(fù)合飲料感官評價的影響順序?yàn)椋簹W李汁添加量（A）＞蔗糖添加量（D）＞沙棘添加量（C）＞山楂汁添加量（B）。由表4方差分析可知，歐李汁添加量對復(fù)合飲料配比工藝有顯著性影響（P＜0.05），山楂汁、沙棘汁、蔗糖添加量影響不顯著，最佳配比為A2B2C1D2，即歐李汁添加量40.0%，山楂汁添加量15.0%，沙棘汁添加量1.0%，蔗糖添加量14 g/L。在最佳配比條件下，經(jīng)3次平行試驗(yàn)，制得的飲料感官評分為34.3分，高于9組正交試驗(yàn)結(jié)果，此時飲料呈亮紅色、口感協(xié)調(diào)、組織狀態(tài)均勻無分層。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of the orthogonal test

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variancetable

2.3 歐李山楂沙棘復(fù)合飲料對小鼠負(fù)重游泳時間的影響

表5為各組動物的力竭游泳時間，由表5可知，與空白組相比，中、高劑量組力竭游泳時間均明顯延長，存在極顯著性差異（P＜0.01）；低劑量組無顯著性差異。負(fù)重游泳試驗(yàn)是最常用的行為絕望動物模型之一，已被廣泛用于評估新型化合物的抗疲勞特性[21]。本研究數(shù)據(jù)顯示，歐李山楂沙棘復(fù)合飲料能顯著延長小鼠力竭游泳時間，提高其運(yùn)動耐受性。

表5 復(fù)合飲料對小鼠力竭游泳時間的影響Table 5 Effect of compound beverage on exhaustive swimming time in mice

2.4 歐李山楂沙棘復(fù)合飲料對小鼠血清中尿素氮、乳酸、肝糖原含量的影響

各組小鼠運(yùn)動后BLA、BUN、HG含量見表6。由表6可知，與空白組相比，中劑量組尿素氮含量具有顯著性差異（P＜0.05），乳酸含量有極顯著性差異（P＜0.01）；高劑量組尿素氮含量及乳酸含量與空白組相比均具有極顯著性差異（P＜0.01）；不同劑量組動物體內(nèi)HG含量與空白組相比均升高，其中低劑量組有顯著性差異（P＜0.05），中、高劑量組具有極顯著性差異（P＜0.01）。因此可知，歐李山楂沙棘復(fù)合飲料有助于減少小鼠運(yùn)動后BLA及BUN的積累，增加小鼠的HG含量，為其在運(yùn)動過程中補(bǔ)充能量。

表6 復(fù)合飲料對小鼠尿素氮、乳酸和肝糖原含量的影響Table 6 Effect of compound beverage on the contents of BUN,BLA and HGin mice

2.5 歐李山楂沙棘復(fù)合飲料對小鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響

由表7可知，與空白組相比，中、高劑量組小鼠SOD活性顯著升高（P＜0.01）；低、中、高劑量組GSH活性均比空白組顯著升高，且均呈極顯著性差異（P＜0.01）；低、中、高劑量組MDA含量均比空白組降低，其中低劑量組為顯著性差異（P＜0.05），中、高劑量組均為極顯著性差異（P＜0.01）。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，歐李山楂沙棘復(fù)合飲料能提高小鼠體內(nèi)抗氧化能力。

3 討論

山楂汁之所以濃縮至原體積1/2，是為了增加其濃度和顏色，降低香氣，避免掩蓋歐李果的特殊香氣。單因素試驗(yàn)中，沙棘汁最佳添加量為1.5%，但經(jīng)過正交優(yōu)化后，最佳添加量為1.0%，這是因?yàn)樯臣砑恿枯^高時，復(fù)合飲料的口感偏酸，分層現(xiàn)象嚴(yán)重，并且沙棘香氣過于濃郁。

糖酵解是短時間內(nèi)劇烈運(yùn)動的主要能量來源，血乳酸是碳水化合物在無氧狀態(tài)下的糖酵解產(chǎn)物[22]。血尿素氮是蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物。長期運(yùn)動后，糖和脂肪分解代謝不足，蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝會變強(qiáng)，尿素氮顯著增加[23]。此外，糖原是運(yùn)動時重要的能量來源，增加肝臟中儲存的糖原可以增強(qiáng)運(yùn)動耐力，消耗肝糖原會產(chǎn)生疲勞[24-25]，因此，本試驗(yàn)選擇血乳酸、尿素氮、肝糖原為疲勞相關(guān)指標(biāo)。

SOD是一種重要的抗氧化酶,當(dāng)體內(nèi)有大量的SOD時，可加速疲勞期后的恢復(fù)[26]；當(dāng)MDA含量過高時，容易抑制ATP的產(chǎn)生并造成疲勞[27]。本試驗(yàn)通過小鼠抗氧化試驗(yàn)證明，小鼠每日灌胃歐李山楂沙棘復(fù)合飲料濃度增高時，小鼠體內(nèi)SOD活性上升，MDA含量降低，其間具有顯著的量-效關(guān)系。當(dāng)小鼠每日灌胃復(fù)合飲料的劑量為0.3 mL/10 g BW時，其體內(nèi)SOD活性為（33.45±1.20）U/mg Prot，MDA含量為（1.86±0.13）nmol/mg Prot，此時復(fù)合飲料抗氧化抗疲勞作用最佳。

4 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交優(yōu)化試驗(yàn)確定了歐李山楂沙棘復(fù)合飲料最佳配比為：歐李汁添加量40.0%，山楂汁添加量15.0%，沙棘汁添加量1.0%，蔗糖添加量14 g/L，所得飲料呈亮紅色、口感協(xié)調(diào)、組織狀態(tài)均勻無分層。

以小鼠為研究對象，連續(xù)對小鼠灌胃歐李山楂沙棘復(fù)合飲料20 d后進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)，結(jié)果表明，歐李山楂沙棘復(fù)合飲料可減輕小鼠力竭游泳引起的氧化應(yīng)激，降低其血乳酸和氨等代謝產(chǎn)物，改善肝糖原的合成和儲備，提高小鼠抗疲勞能力。