李云霞，趙 玲，趙明利，呂東津，郝 舒，吳 娜，周文鼎

（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科1，微創(chuàng)介入科2，云南 昆明 650118）

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是由腫瘤細(xì)胞引起的惡性免疫系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)病或?qū)嶓w瘤[1，2]。其分類復(fù)雜，世界衛(wèi)生組織（WHO）已列出了50 多種不同的亞型的組織分類[3]。長期以來，非霍奇金淋巴瘤的標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案為CHOP 方案，即環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松龍[4，5]。然而在一線治療后，有半數(shù)以上患者會轉(zhuǎn)化為復(fù)發(fā)難治性非霍奇金淋巴瘤，預(yù)后較差。針對這類患者的化療方案不統(tǒng)一，尚無標(biāo)準(zhǔn)治療方案[6，7]。有研究報(bào)道[8-10]，鉑類化療藥物和吉西他濱可用于非霍奇金淋巴瘤二線及以上的治療。有研究比較順鉑、吉西他濱和地塞米松聯(lián)合治療復(fù)發(fā)難治性非霍奇金淋巴瘤的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者實(shí)現(xiàn)了較好的臨床應(yīng)答并且安全耐受性良好[11]。奈達(dá)鉑是新一代的鉑類抗腫瘤藥物，與順鉑相比，具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，已在部分國家批準(zhǔn)用于多種癌癥的治療[12]。因此，奈達(dá)鉑有望成為非霍奇金淋巴瘤化療的藥物選擇之一。本研究擬探索新型鉑類化療藥物奈達(dá)鉑和吉西他濱聯(lián)用抑制非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，以期為臨床治療復(fù)發(fā)難治性非霍奇金淋巴瘤以及改善患者預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MINO 和SU-DHL-4 非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，使用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 μ/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素），在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)。PBS 粉末（索萊寶）完全溶解于2000 ml 蒸餾水中，混勻后，調(diào)整pH 值在7.2～7.4，備用。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自ThermoFisher。FITC 標(biāo)記的CDK1 和CDK4 抗體購自Abcam。

1.2 方法

1.2.1 MTT 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 在96 孔板中分別接種兩種NHL 細(xì)胞，密度達(dá)到5000 細(xì)胞每孔，3 個實(shí)驗(yàn)組分別加入4、2、1、0.5 和0.25 nM的吉西他濱和奈達(dá)鉑以及二者的混合物，另外沒有藥物處理的細(xì)胞作為對照組。培養(yǎng)72 h 后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μl的0.5 mg/ml的MTT 在培養(yǎng)箱種孵育4 h。然后棄液體并在每孔加入100 μl的DMSO，待結(jié)晶全部溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm 處測量吸光度值。每個濃度進(jìn)行3 次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡兩種NHL 細(xì)胞株接種在6 孔板中，以20 萬細(xì)胞/孔的密度接種，3 個實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞分別用1 nM 吉西他濱、奈達(dá)鉑和奈達(dá)鉑+吉西他濱處理72 h，PBS 清洗3 次之后，使用細(xì)胞周期試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，通過表征每個細(xì)胞的DNA 含量并用碘化丙啶（PI）染色進(jìn)行分析。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)則在含有5 μl 異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V 和5 μg/ml的PI的100 μl 鈣結(jié)合緩沖液中對1×105個完整細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，在黑暗中孵育15 min，然后通過流式細(xì)胞術(shù)（FACS）進(jìn)行分析。

1.2.3 免疫熒光檢測細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK1和CDK4的表達(dá) 兩種NHL 細(xì)胞株接種在玻璃底培養(yǎng)皿中，以50 萬細(xì)胞/孔的密度接種。3 個實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞分別用1 nM 吉西他濱、奈達(dá)鉑和奈達(dá)鉑+吉西他濱處理72 h，棄培液，用PBS 清洗3 次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，重復(fù)PBS 清洗過程。用0.1%Triton X-100 處理5 min 后再次清洗。使用5%脫脂奶粉的TBST 封閉細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育1 h 后，分別使用FITC 標(biāo)記的CDK1 和CDK4 抗體進(jìn)行標(biāo)記，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用TBST 清洗3 次之后在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測。綠色熒光強(qiáng)度代表CDK1 和CDK4的表達(dá)量，比較奈達(dá)鉑組、吉西他濱組、奈達(dá)鉑+吉西他濱組和對照組的熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析處理采用Graphpad Prism 7.0 進(jìn)行，計(jì)量資料以（）表示，行非配對Students't檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 奈達(dá)鉑組、吉西他濱組和奈達(dá)鉑+吉西他濱組細(xì)胞活力比較 奈達(dá)鉑組、吉西他濱組和奈達(dá)鉑+吉西他濱組均抑制兩種NHL 細(xì)胞株的增殖，其中奈達(dá)鉑+吉西他濱組抑制效果最顯著，且隨著藥物等比稀釋濃度逐漸降低，細(xì)胞活力的抑制率也逐漸降低；另外，奈達(dá)鉑組和吉西他濱組的抑制率在SU-DHL-4細(xì)胞株相較于MINO 中更低，見圖1。

圖1 不同藥物及濃度對MINO 和SU-DHL-4 非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 奈達(dá)鉑組、吉西他濱組和奈達(dá)鉑+吉西他濱組細(xì)胞凋亡比較 圖2 和圖3 分別顯示奈達(dá)鉑組、吉西他濱組及奈達(dá)鉑+吉西他濱組在SU-DHL-4及MINO細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的情況。4 個象限分別代表細(xì)胞的不同狀態(tài)，其中左下角表示正常細(xì)胞群，左上角是壞死的細(xì)胞群，右上角是早期凋亡細(xì)胞群而右下角為晚期凋亡細(xì)胞群。在未使用化療藥物處理的對照組中，大多數(shù)細(xì)胞群落入左下角象限。在SU-DHL-4細(xì)胞中，吉西他濱組10%左右的細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，約20%的細(xì)胞發(fā)生壞死。而奈達(dá)鉑組和奈達(dá)鉑+吉西他濱組細(xì)胞主要發(fā)生晚期凋亡。在MINO 細(xì)胞中，奈達(dá)鉑組、吉西他濱組和奈達(dá)鉑+吉西他濱組細(xì)胞均發(fā)生早期和晚期凋亡。

圖2 奈達(dá)鉑和吉西他濱對SU-DHL-4 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

圖3 奈達(dá)鉑和吉西他濱對MINO 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

2.3 奈達(dá)鉑組、吉西他濱組和奈達(dá)鉑+吉西他濱組細(xì)胞周期阻滯比較 由圖4 和圖5 可知，對照組的腫瘤細(xì)胞一半左右處于G1期。在SU-DHL-4 細(xì)胞中，奈達(dá)鉑組44.5%的細(xì)胞處于S 期，吉西他濱組42.2%的細(xì)胞處于S 期，奈達(dá)鉑+吉西他濱組有52.3%的細(xì)胞處于S 期。在MINO 細(xì)胞中也得到類似的結(jié)果，奈達(dá)鉑組、吉西他濱組以及奈達(dá)鉑+吉西他濱組的細(xì)胞處于S 期的比例增加，其中吉西他濱組的S 期比例最高，達(dá)到50.9%。

圖4 奈達(dá)鉑和吉西他濱對SU-DHL-4 細(xì)胞周期的作用

圖5 奈達(dá)鉑和吉西他濱對MINO 細(xì)胞周期的作用

2.4 奈達(dá)鉑組、吉西他濱組和奈達(dá)鉑+吉西他濱組細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK1 和CDK4的表達(dá)比較圖6 和圖7 分別顯示對照組和3 個實(shí)驗(yàn)組的兩種NHL 細(xì)胞的CDK1 和CDK4 表達(dá)情況，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)代表蛋白表達(dá)越多。對照組兩個細(xì)胞株的CDK1和CDK4的表達(dá)水平均最高，奈達(dá)鉑組和吉西他濱組的CDK1 和CDK4 表達(dá)降低，奈達(dá)鉑+吉西他濱組的CDK1 和CDK4的表達(dá)量最低，幾乎不顯示綠色熒光。

圖6 奈達(dá)鉑和吉西他濱調(diào)節(jié)MINO 細(xì)胞CDK1 和CDK4 表達(dá)

圖7 奈達(dá)鉑和吉西他濱調(diào)節(jié)SU-DHL-4 細(xì)胞CDK1 和CDK4 表達(dá)

3 討論

本研究使用MINO 和SU-DHL-4 兩種非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株，通過MTT 實(shí)驗(yàn)證實(shí)奈達(dá)鉑和吉西他濱可以抑制兩種NHL 細(xì)胞株增殖，并且隨著藥物濃度增加，抑制增殖率也隨之增加。兩種藥物聯(lián)合使用相較于單一藥物抑制細(xì)胞增殖效果更加明顯。在此基礎(chǔ)上，兩種藥物也可以阻滯細(xì)胞周期，使更多比例的細(xì)胞發(fā)生G2-M 期阻滯。吉西他濱和奈達(dá)鉑可以誘導(dǎo)NHL 細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡和晚期凋亡，而聯(lián)合組的晚期凋亡比例進(jìn)一步提高，提示聯(lián)合用藥可以進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡。奈達(dá)鉑和吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯通過下調(diào)CDK1 和CDK4的表達(dá)，免疫熒光結(jié)果顯示，奈達(dá)鉑聯(lián)合吉西他濱降低CDK1 和CDK4 表達(dá)幅度最顯著。

吉西他濱具有細(xì)胞周期特異性，主要?dú)⑺勒诮?jīng)歷DNA 合成（S 期）的細(xì)胞，也可以抑制進(jìn)展細(xì)胞通過G1/S 間期。吉西他濱通過其兩種活性代謝物抑制DNA 復(fù)制和合成的多種作用機(jī)制發(fā)揮其細(xì)胞毒作用[13]。吉西他濱在治療各類NHL 中進(jìn)行了廣泛的嘗試[14-16]。研究顯示[17]，在胰腺癌中，吉西他濱可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和引起S 期細(xì)胞周期阻滯，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究中，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示吉西他濱誘導(dǎo)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，對照組細(xì)胞占比最高的處于G1期，而吉西他濱和奈達(dá)鉑處理后細(xì)胞周期最高占比由G1期轉(zhuǎn)化為S 期，這提示大部分細(xì)胞處于DNA 合成期，而吉西他濱正好作用于這一時期的細(xì)胞，發(fā)揮抑制腫瘤的作用。吉西他濱聯(lián)合鉑類化療藥物也是經(jīng)典的治療方案選擇。有研究比較了吉西他濱聯(lián)合順鉑與吉西他濱聯(lián)合奧沙利鉑治療NHL的臨床療效，結(jié)果表明兩個方案的臨床有效性相當(dāng)，但聯(lián)合奧沙利鉑具有更小的副作用和更好的安全耐受性[18，19]。部分臨床研究也探索了奈達(dá)鉑在NHL 中的使用。研究表明[20]，替莫唑胺、奈達(dá)鉑和長春新堿聯(lián)合使用治療原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤具有一定的潛力和安全性。Wang H 等[21]研究顯示奈達(dá)鉑處理耐藥細(xì)胞后凋亡率明顯增加，G2期細(xì)胞數(shù)也明顯增多。本研究探索了奈達(dá)鉑在NHL 中的機(jī)制研究，從細(xì)胞周期相關(guān)的通路驗(yàn)證了奈達(dá)鉑可以抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，奈達(dá)鉑+吉西他濱組的研究結(jié)果也顯示在NHL中奈達(dá)鉑和吉西他濱具有協(xié)同作用，提示兩種藥物聯(lián)合治療NHL 可能會取得更好的效果。

綜上所述，本研究從機(jī)制層面證實(shí)吉西他濱和奈達(dá)鉑通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK1 和CDK4的表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯，從而誘導(dǎo)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡，最終抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮殺傷腫瘤的作用。此外，吉西他濱聯(lián)合奈達(dá)鉑的效果優(yōu)于兩者單一藥物。