趙 昕，陳宣齊，張燕翔，李雅軒**

（1.首都師范大學生命科學學院，北京 100048；2.北京市第十中學，北京 100072；3.首都師范大學初等教育學院，北京 100048）

0 引 言

微核（micronucleus，MCN）是細胞在分裂間期表現(xiàn)出的一種畸變類型，是環(huán)境因素的作用下，引起真核生物細胞的染色體斷裂或整條染色體移動異常，導致細胞分裂后期沒有進入子核中而產生的獨立于主核之外的微小核結構[1].微核在細胞分裂間期的形狀多與主核形狀類似，大小約為主核大小的1/10～1/3，靠近主核，其染色性質與主核相類似.一般情況下，微核自發(fā)發(fā)生率很低，故可作為檢測環(huán)境因素對遺傳物質影響效果的指標，即通過微核檢測研究環(huán)境因素的安全性，建立微核檢測技術[1-3].目前，微核檢測已成為毒理性檢測與評定的常規(guī)方法[4-7].

微核試驗（micronucleus test，MNT）以動物的骨髓細胞或外周血淋巴細胞、蠶豆等為研究對象，探究環(huán)境因素的毒理作用，且隨著生物技術的發(fā)展，其應用范疇已從體內檢測拓展到體外檢測[8-10].王映雪[11]、儀慧蘭和孟紫強[12]分別以蠶豆（Vicia faba）根尖進行微核檢測，表明植物微核檢測方法與動物學檢測方法具有高度一致性，且具有材料易得、培養(yǎng)條件簡單和實驗周期短等優(yōu)勢；張麗霞等[5]比較了單細胞凝膠電泳實驗和蠶豆根尖微核檢測技術，證明二者研究結果一致，且由于蠶豆根尖微核檢測技術在實驗上的便捷性，該技術已成為對待測因素進行遺傳毒理性分析的常用方法；劉增禹和蔡文國[6]利用微核檢測技術，表明某品牌方便面調料對蠶豆根尖細胞存在遺傳毒理性；李藝等[13]利用微核檢測技術，表明杏鮑菇（Pleurotus eryugii）提取液有效降低了微核出現(xiàn)的比率；李雅軒等[14]在對有機硒粉的研究中，證實適當濃度的有機硒粉對NaNO2所導致的染色體損傷具有拮抗作用，可以有效降低染色體損傷，并且具有劑量效應.以上研究結果表明，微核檢測方法是對食品安全性進行評估的有效方法.

辣條是一種以谷物或豆類為主要原料的常見小零食，目前沒有統(tǒng)一的制作標準，其制作中會添加甜味劑、增味劑、乳化劑和防腐劑等食品添加劑，有些辣條甚至含有20余種食品添加劑.由于辣條的購買成本低和經銷商的花式營銷手段，使得其深受青少年們的喜愛[15-19].雖然國家有相關規(guī)定限制各類食品添加劑的使用量[20-21]，但是當多種食品添加劑疊加使用時，其食品安全性還需要進一步確認.目前尚沒有類似研究的報告，本文以蠶豆根尖為研究對象，通過微核檢測分析辣條的食用安全性，以進一步豐富以蠶豆為實驗材料的遺傳毒理分析研究，希望為辣條的食品安全性評價提供實驗數(shù)據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

無水乙醇、冰醋酸和苯酚購自北京化工有限責任公司，均為分析純；環(huán)磷酰胺購自MACKLIN/麥克林試劑公司；品紅購自北京Leagene/雷根生物技術有限公司.實驗所用H2O為去離子水.

1.2 辣條提取液的制備

選擇某品牌辣條為分析對象.使用食品粉碎器粉碎辣條，取20 g加100.00 mLH2O，24℃浸泡2 h，濾紙過濾，將濾液定容至100 mL，命名為原提取液，4℃冰箱中保存.

分別取原提取液 0.25、2.50、12.50和 25.00 mL，加H2O分別稀釋至50.00 mL，得到稀釋倍數(shù)分別為200、20、4和2倍的溶液，進行后續(xù)研究.

1.3 蠶豆根尖處理

選取美農匯種子公司生產的臨蠶9號種子（青皮蠶豆）為實驗測試用種子，要求籽粒均勻飽滿、形態(tài)大小相似.培養(yǎng)步驟：（1）將種子浸泡于H2O中24 h；（2）將膨脹后的種子轉移至鋪有雙層濕紗布和有少量H2O的白瓷盤中，24℃下繼續(xù)培養(yǎng)催根，每隔12 h換1次H2O；（3）待種子的初生根長度達到2 cm左右時，選取42粒種子，隨機分為7組，分別為空白組、對照組和實驗1～5組（按稀釋倍數(shù)由高到低排序），每組6粒種子；（4）分別加入50.00 mL的H2O、5 mg/L 環(huán)磷酰胺[22-23]和不同稀釋倍數(shù)（200、20、4、2和0倍）的辣條提取液，24℃培養(yǎng)蠶豆根尖6 h；（5）用H2O清洗種子和根尖3次，置于墊有雙層濕紗布的培養(yǎng)皿內，以H2O緩苗培養(yǎng)24 h；（6）取2 cm根尖置于卡諾固定液中，固定24 h；（7）取固定后的根尖放于70%乙醇溶液中，4℃冰箱中冷藏，待測.每組實驗重復3次.

1.4 微核分析

使用濟南騰覽儀器有限公司生產的Leica DM 500型顯微鏡觀察統(tǒng)計處理后根尖中的微核數(shù).以常規(guī)方法進行制片[24]，每個蠶豆根尖觀察1 000個細胞進行計數(shù)，每組觀察2個根尖，每組實驗重復3次，共計觀察6 000個細胞.統(tǒng)計每個根尖具有微核的細胞數(shù)（n），計算微核率（P）和微核指數(shù)（IM），對應計算公式為：

式中：P實和P空分別為實驗1～5組（或對照組）與空白組的P；IM也稱為污染指數(shù)（pollution index，PI），當 0＜IM＜1.50為基本無遺傳毒性，1.50≤IM＜2.00為具有輕度遺傳毒性，2.00≤IM＜3.50為中度遺傳毒性，IM≥3.50為重度遺傳毒性，IM＞1.50就判定為存在致突變作用[9-10].

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以±s表示.利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析.根據(jù)微核指數(shù)判斷測試提取液的遺傳毒性，使用t檢驗進行組間微核數(shù)據(jù)對比分析.利用最小二乘法構建稀釋度的倒數(shù)與微核數(shù)的回歸方程，對回歸系數(shù)進行顯著性檢驗.P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結 果

2.1 蠶豆根尖細胞微觀結構

所有組蠶豆根尖細胞的微觀結構如圖1所示.空白組，根尖細胞近似為正方體，細胞核為圓形或橢圓形，形狀均勻一致；對照組，根尖細胞中可見明顯的細胞核變形，產生突出，出現(xiàn)三角形或局部銳化現(xiàn)象；實驗1～5組，根尖細胞中均有微核出現(xiàn)，細胞核形態(tài)可見大量明顯變形，與對照組細胞核表現(xiàn)相類似，其中實驗5組宏觀可見根尖表面顏色發(fā)暗，微觀細胞核變形更為顯著，其根尖細胞受損傷嚴重.

圖1 不同組蠶豆根尖細胞的微核結構（a）空白組；（b）對照組；（c）實驗1組；（d）實驗2組；（e）實驗 3組；（f）實驗4組；（g）實驗 5組

2.2 微核數(shù)據(jù)

不同組處理后蠶豆根尖細胞微核統(tǒng)計結果如表1所示.空白組、對照組和實驗1～5組的微核數(shù)分別為9、39和14～30個，微核千分率分別為1.50‰±1.22‰、6.50‰±3.89‰ 和 2.33‰±1.97‰～5.00‰±2.19‰，IM分別為 1.00、4.33和 1.55～3.33.與空白組相比，實驗1和5組的微核率有所增加，但結果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗2～4組的微核率顯著增加（t=1.96、2.49和3.42，P＜0.05）；與對照組相比，實驗1和2組微核率顯著減少（t=-2.34和-2.07，P＜0.05），實驗 3～5組的微核率降低，但結果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）.

表1 不同組處理后蠶豆根尖細胞微核統(tǒng)計結果

2.3 相關性分析

對在本實驗中顯示適于進行微核檢測的實驗1～4組進行相關性分析.利用最小二乘法構建的回歸方程為y=31.11x+15.74，r=0.962；對回歸系數(shù)的顯著性檢驗可知，微核數(shù)在提取液稀釋倍數(shù)范圍內的線性回歸顯著（P＜0.05）.可知，在研究處理液濃度范圍內，微核數(shù)隨著處理液濃度的升高而增加.

3 討 論

微核數(shù)據(jù)顯示，辣條提取液處理根尖后，可見微核數(shù)明顯升高，說明其對染色體有損傷作用，使得細胞中微核數(shù)增加.實驗1組因稀釋度高，其未造成與空白組的顯著差異，說明稀釋200倍的提取液不具明顯遺傳毒性；實驗2～4組與空白組處理效果形成顯著差異，說明稀釋20～2倍的辣條提取液已具有明顯的遺傳毒性，但其食用安全性有待于進一步研究確定；實驗5組的微核率比實驗4組有所降低，致畸作用未見顯著大于實驗4組，且與空白組亦不具有顯著差異.

分析實驗5組數(shù)據(jù)，這是因為微核的形成，依賴于細胞周期的正常發(fā)生，文中緩苗處理，也是期待受到環(huán)境誘導而發(fā)生損傷的染色體，在下一個細胞周期中的間期不能進入到子核中，形成的染色體斷片或落后染色體成為獨立于子核以外的微核，以此反映實驗因素的遺傳毒性.數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，實驗5組的微核總數(shù)比空白組有顯著增大，但是分布極不平均，6個根尖細胞中出現(xiàn)的微核數(shù)分別為0、0、10、0、9和0個（共19個）；而實驗4組的6個根尖細胞中出現(xiàn)的微核數(shù)分別為8、4、4、2、7和 5個（共 30個）.結合根尖表型及其細胞表現(xiàn)特點，推測實驗5組由于細胞受損或細胞分裂受到抑制，導致微核數(shù)降低，甚至為0，其出現(xiàn)微核的細胞來自于2個根尖，其余4個根尖的細胞中未測出微核.進一步觀測這4個根尖的細胞分裂水平，亦發(fā)現(xiàn)處于分裂期的細胞數(shù)顯著減少，表現(xiàn)為細胞分裂受到抑制，所以未能觀察到微核出現(xiàn).結合細胞學觀察，判斷實驗5組的根尖細胞是由于細胞分裂受到抑制，影響了微核形成的過程，說明其影響作用更為顯著，只是不適于利用微核檢測的方法判斷其遺傳毒性，這從另一面說明高濃度提取液對染色體的影響非常嚴重.此研究結果與前人的工作相印證，所以微核試驗分析需要確定待測因素的適用濃度范圍[25-26]，選擇適當?shù)臐舛染哂兄匾饬x.如果處理液過濃，可以通過增加稀釋度，得到數(shù)據(jù)后再進行數(shù)據(jù)校正，也可得到正確的結論.

與對照組相比，實驗組的微核數(shù)和微核千分率均有所減少，且實驗1和2組微核數(shù)及微核千分率顯著減少，說明實驗1和2組辣條提取液未達到5 mg/L環(huán)磷酰胺的遺傳毒性水平；實驗3～5組的微核率降低，但結果無顯著性差異，說明實驗組3～5提取液的遺傳毒性與5 mg/L環(huán)磷酰胺相當，由此進一步確認了此稀釋度范圍內的辣條浸提液對染色體有明顯損傷作用，與對照組具有相同的遺傳毒性.

微核指數(shù)結果表明，不同稀釋度的辣條提取液均有一定遺傳毒性（IM＞1.50）.其中稀釋200倍的提取液具有輕度遺傳毒性，IM=1.55；其余提取液均具有中度遺傳毒性，IM為2.00～3.33.在實驗2～4組稀釋度的范圍內，隨著稀釋度的降低（濃度增大）微核數(shù)在增多，相關分析結果顯示，微核數(shù)與濃度的簡單相關系數(shù)高且線性回歸顯著，說明在此研究稀釋度范圍內，辣條提取液的濃度與誘導所產生的微核數(shù)呈正相關關系.

辣條包裝上的成分表顯示，在其生產中使用了多種食品添加劑，包括了谷氨酸鈉、單硬脂酸甘油酯、丙三醇、環(huán)已基氨基硫酸銨、乳酸鈉、三氯蔗糖、特丁基對苯二酚、紐甜和食用香精香料等，成分過于復雜.結合本研究，有理由推測多種食品添加劑的使用，無論是劑量或種類的疊加作用都會對食品安全性產生不利的影響.

2019年12月10 日，我國市場監(jiān)管總局發(fā)布《關于加強調味面制品質量安全監(jiān)管的公告》[20-21]顯示，各地市場監(jiān)管部門對“辣條”類食品統(tǒng)一按照“方便食品（調味面制品）”生產許可類別進行管理，提出了更加嚴格的制作要求和檢測標準，凡與此不一致的，應當于2020年1月31日前調整到位.參照方便食品管理意味著，能添加的防腐劑僅為“乳酸鏈球菌素”，將大大減少添加劑的種類.而隨著其性質的明確，辣條在添加劑使用、產品保質期等方面將面臨更高的要求，這也意味著辣條行業(yè)生產將會更加規(guī)范化.

4 結束語

本研究利用微核檢測技術，以原提取液及不同稀釋倍數(shù)的辣條提取液處理蠶豆根尖細胞，表明實驗稀釋度范圍內的辣條提取液均可誘導微核產生，具有一定遺傳毒性，并呈現(xiàn)劑量效應.辣條提取液越濃，對染色體具有明顯損傷作用.本研究是依據(jù)前人的工作，以蠶豆根尖細胞為實驗材料進行了研究分析.在今后的工作中，可以模式動物作為研究對象進行更深入研究，對辣條提取液中具體成分進行具體毒理性分析，從而對確立辣條生產中的食品安全性指標提供參考依據(jù).