樊 玲，趙景杰

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)約占全部口腔癌的90%，是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，因局部侵襲性和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，OSCC的5年生存率僅為60%[1]。最差浸潤(rùn)方式代表腫瘤侵襲性，已成為影響OSCC預(yù)后的重要組織病理學(xué)因素，最差浸潤(rùn)方式分級(jí)越高患者復(fù)發(fā)率越高，術(shù)后生存時(shí)間越短[2]。HE等[3]研究指出，腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的關(guān)鍵因素之一為血小板源性生長(zhǎng)因子及其受體間的相互作用。血小板源性生長(zhǎng)因子B(PDGFB)與血小板源性生長(zhǎng)因子受體β(PDGFRβ)相互作用，誘導(dǎo)PDGFRβ磷酸化并激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，而細(xì)胞增殖、存活和血管生成等多種生理活動(dòng)都離不開(kāi)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路，提示該通路可能是潛在的抗腫瘤治療靶點(diǎn)[4-5]。薏苡仁為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁，味甘淡，性微寒，薏苡仁提取物已證明在抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等多方面有良好的作用，但目前薏苡仁提取物對(duì)OSCC的抗腫瘤作用相關(guān)研究較少[6]。故本研究通過(guò)觀察不同作用濃度薏苡仁提取物對(duì)人OSCC CAL27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其潛在作用機(jī)制，旨在為OSCC治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 薏苡仁提取物(西安金綠生物工程技術(shù)有限公司，批號(hào)：1312046-3)；RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：HB-FBS-1B、HB-FBS-500)；結(jié)晶紫染液、聚偏氟乙烯膜、細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：P0033、C1027、SF4033)；PDGFB、PDGFRβ、磷酸化PDGFRβ(p-PDGFRβ)、PI3K、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)和β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：HZ-06458、HZ-064458、HZ-0684R2、HZ-0670R18、HZ-0611R18、HZ-4856R48和HZ-0742R1)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：115-58-264)。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人OSCC CAL27細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，批號(hào)：CM-1250。37 ℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為高劑量組、低劑量組、對(duì)照組。高、低劑量組分別予20、10 μmol/L薏苡仁提取物干預(yù)[6]，對(duì)照組不予任何干預(yù)。各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 各組以每孔5×103個(gè)細(xì)胞濃度接種于96孔板，待細(xì)胞融合后按“1.2”項(xiàng)方法干預(yù)24 h后加入MTT(每孔20 μl)，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm處吸光度(OD)值計(jì)算細(xì)胞增殖率，空白組為只添加培養(yǎng)基細(xì)胞，細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)。

1.4細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 各組以每孔5×104個(gè)細(xì)胞濃度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合，于單層細(xì)胞上用滅菌槍頭做“一”字劃痕，無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基清洗3次，按“1.2”項(xiàng)方法干預(yù)24 h后顯微鏡拍照，圖像分析儀測(cè)量劃痕寬度。

1.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力 各組以每孔5×104個(gè)細(xì)胞濃度接種于24孔Transwell小室中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，按“1.2”項(xiàng)方法干預(yù)24 h，取出小室，PBS洗滌后4%甲醛固定10 min，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)紫色穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組以每孔5×104個(gè)細(xì)胞濃度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合按“1.2”項(xiàng)方法干預(yù)24 h后獲取細(xì)胞，據(jù)細(xì)胞量加入細(xì)胞蛋白抽提試劑裂解2 h；經(jīng)SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，后用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，然后加入PDGFB(1∶250)、PDGFRβ(1∶200)、p-PDGFRβ(1∶500)、PI3K(1∶300)、Akt(1∶200)、p-Akt(1∶300)和β-actin(1∶1000)抗體4 ℃條件下孵育過(guò)夜，TBST緩沖液沖洗膜2次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)室溫下孵育30 min后顯色，采集圖像分析。

2 結(jié)果

2.1不同濃度薏苡仁提取物對(duì)CAL27細(xì)胞增殖率和遷移能力的影響 高、低劑量組細(xì)胞增殖率和遷移能力明顯低于對(duì)照組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1和圖2。

表1 不同濃度薏苡仁提取物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

圖2 不同濃度薏苡仁提取物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞遷移能力的影響

2.2不同濃度薏苡仁提取物對(duì)CAL27細(xì)胞侵襲的影響 對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)為(510.08±91.54)個(gè)，低、高劑量組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(257.89±56.28)個(gè)、(182.61±30.72)個(gè)。高、低劑量組細(xì)胞侵襲數(shù)低于對(duì)照組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度薏苡仁提取物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×200)

2.3不同濃度薏苡仁提取物對(duì)CAL27細(xì)胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達(dá)的影響 高、低劑量組PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖4。

圖4 不同濃度薏苡仁提取物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達(dá)的影響

表2 不同濃度薏苡仁提取物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達(dá)的影響

2.4不同濃度薏苡仁提取物對(duì)CAL27細(xì)胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響 3組Akt蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高、低劑量組PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖5。

表3 不同濃度薏苡仁提取物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響

圖5 不同濃度薏苡仁提取物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，OSCC發(fā)病率較高，多數(shù)患者因腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而造成死亡。故亟須尋找可以對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和遷移起抑制作用的有效藥物。薏苡仁甘油酯為薏苡仁提取物的主要成分，其成品制劑康萊特注射液已用于臨床，對(duì)多種惡性腫瘤具有較好療效，可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并顯著提高患者機(jī)體免疫功能[7-8]。然而，其具體的作用機(jī)制及最佳作用濃度仍不十分清楚。故本研究評(píng)估不同濃度薏苡仁提取物對(duì)人OSCC CAL27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及作用機(jī)制，研究結(jié)果顯示，高、低劑量組細(xì)胞增殖率、遷移能力、細(xì)胞侵襲數(shù)低于對(duì)照組，且高劑量組低于低劑量組。提示薏苡仁提取物可能是OSCC的潛在治療靶點(diǎn)，且干預(yù)濃度越高抗腫瘤作用越佳。分析產(chǎn)生上述結(jié)果的原因?yàn)?，薏苡仁提取物通過(guò)阻斷G2與M期腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G0、G1期，并減少S期腫瘤細(xì)胞比例，減少細(xì)胞分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖或腫瘤血管生成，起到良好的抗腫瘤效應(yīng)。

PDGF是體外平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的主要促分裂原[9]。HOSAKA等[10]研究指出，腫瘤細(xì)胞增殖、遷移以及功能性脈管系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵為PDGFB和PDGFRβ間的相互作用。ZHOU等[11]研究顯示，上調(diào)PDGFB表達(dá)可刺激血管損傷大鼠模型頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，提示PDGFB有助于動(dòng)物模型血管損傷后的修復(fù)或重塑。TANNENBERG等[12]研究還發(fā)現(xiàn)，減少血管成形術(shù)后血管修復(fù)和重塑的關(guān)鍵是抑制PDGFB信號(hào)傳導(dǎo)通路活性。VU等[13]和FORTE等[14]研究認(rèn)為，在多種上皮癌自分泌刺激腫瘤生長(zhǎng)及旁分泌刺激腫瘤相關(guān)血管生成過(guò)程中，PDGFB和PDGFRβ起關(guān)鍵作用。有研究顯示，PDGFB主要在OSCC組織腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高[15]，激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[16-17]。本研究結(jié)果顯示，高、低劑量組PDGFB、PDGFRβ、p-PDGFRβ、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，且高劑量組低于低劑量組。提示薏苡仁提取物可能是通過(guò)抑制PDGFB表達(dá)，阻斷PDGFRβ磷酸化并抑制PDGFB/PDGFRβ/PI3K/Akt軸活性，從而抑制人OSCC CAL27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，且干預(yù)濃度越高抗腫瘤效果越佳。

綜上所述，薏苡仁提取物可抑制人OSCC CAL27細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制可能與抑制PDGFB/PDGFRβ/PI3K/Akt軸活性有關(guān)，且干預(yù)濃度越高抗腫瘤效果越佳，為薏苡仁提取物對(duì)OSCC的分子靶向治療提供新的理論依據(jù)。