梁 立，劉艷春，孟立寧，楊 曼，陳宏洋，韓愛勇，岳燕軍

食管癌是源于食管黏膜上皮的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高，分別居于惡性腫瘤的第6位和第4位；食管癌病理類型具有顯著的地域特征，歐美國家以食管腺癌為主，而亞洲國家食管鱗癌發(fā)病率更高[1]。食管癌常見治療手段有放療、化療、外科手術(shù)等，外科手術(shù)是臨床治療早、中期及局部晚期食管癌的主要手段，可有效提高患者生存率，但大部分食管癌患者就診時(shí)已發(fā)展至晚期，且伴有區(qū)域或全身淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，手術(shù)已無法達(dá)到理想治療效果，或患者無法耐受手術(shù)治療，此時(shí)，臨床多采用化療的方式對(duì)患者進(jìn)行治療[2-3]。含鉑類藥物的聯(lián)合化療是目前治療食管癌最常用的方案，但患者經(jīng)鉑類藥物化療后整體5年生存率仍不足20%[4]。因此，尋找可以預(yù)測晚期食管癌鉑類藥物化療預(yù)后的分子標(biāo)志物，并根據(jù)其特點(diǎn)制定新的治療方案，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要臨床意義。人表皮生長因子受體2(HER2)是一種磷酸化受體蛋白，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較高，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和浸潤轉(zhuǎn)移，影響癌癥患者預(yù)后[5-6]。本研究探討腫瘤組織HER2蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增與食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年6月—2019年6月張家口市第一醫(yī)院采用含鉑類藥物化療的晚期食管鱗癌100例的臨床資料，根據(jù)患者隨訪2年預(yù)后情況分為預(yù)后良好組53例和預(yù)后不良組47例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)內(nèi)鏡及病理組織學(xué)檢查確診為晚期食管鱗癌；②均失去手術(shù)治療指征；③一線化療均接受含鉑類藥物的方案；④存在可評(píng)價(jià)的腫瘤病灶；⑤預(yù)計(jì)生存時(shí)間≥3個(gè)月；⑥臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他臟器轉(zhuǎn)移者；②合并嚴(yán)重心、肝、肺、腎損傷者；③合并嚴(yán)重感染者；④合并其他惡性腫瘤者。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1化療方案：所有患者接受含鉑類藥物的化療方案[7]，包括順鉑、奧沙利鉑、卡鉑及奈達(dá)鉑，與含鉑類藥物聯(lián)合化療藥物包括5-氟尿嘧啶、長春瑞濱、長春地辛、多西他賽、紫杉醇、博來霉素、吉西他濱。

1.2.2預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)：以患者隨訪2年的生存情況作為預(yù)后評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，將腫瘤相關(guān)死亡患者納入預(yù)后不良組，生存患者納入預(yù)后良好組。

1.2.3資料收集：通過病歷系統(tǒng)收集兩組入院時(shí)性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、血紅蛋白、白蛋白等各項(xiàng)臨床資料。

1.2.4儀器和方法：取患者空腹血液5 ml，希森美康XN-3000血液分析儀及配套試劑盒測定血紅蛋白、白蛋白水平；取患者入院活組織病理檢查時(shí)的組織標(biāo)本，采用熒光原位雜交技術(shù)檢測HER2/neu基因擴(kuò)增情況，采用免疫組織化學(xué)法檢測HER2蛋白表達(dá)；DNA熒光原位雜交探針、熒光原位雜交TM試劑盒均購自北京金菩嘉生物技術(shù)有限公司；即用型C-erB-2兔抗人單克隆抗體、免疫組織化學(xué)Envision plus廣譜試劑盒、PBS、枸櫞酸鹽緩沖液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.5熒光原位雜交技術(shù)檢測[8]：①采用HER2 DNA熒光原位雜交探針標(biāo)記紅色熒光，設(shè)對(duì)照探針標(biāo)記綠色熒光。a.石蠟切片：在溫度為65 ℃下烤片過夜，標(biāo)本脫蠟至水，50 ℃條件下用酸性亞硫酸鈉(濃度為30%)處理切片，時(shí)間為20～30 min，并用2×枸櫞酸鹽緩沖液漂洗2次，每次5 min；37 ℃條件下在蛋白酶K溶液中孵育20～30 min，2×枸櫞酸鹽緩沖液漂洗2次，每次5 min，室溫下在0.1 mmol/L HCl中浸泡5～10 min，再次用2×枸櫞酸鹽緩沖液漂洗2次，每次5 min；b.脫水：玻片依次在-20 ℃預(yù)冷的濃度為70%、85%、100%乙醇中各脫水2 min，后置于室溫下浸入丙酮溶液中2 min，取出后使玻片自然干燥。②熒光原位雜交技術(shù)：a.脫水：于73 ℃條件下在濃度為70%的甲酚胺變性液中浸泡5 min，后依次在預(yù)冷的濃度為70%、85%、100%乙醇中各脫水3 min；b.雜交：將10 μl探針混合液滴入玻片組織中，蓋片，以橡膠封片，于73 ℃條件下進(jìn)行變性，時(shí)間為5 min，后在42 ℃條件下雜交過夜；c.洗滌：于73 ℃條件下在2×枸櫞酸鹽緩沖液/0.3% NP溶液洗脫液中洗滌，時(shí)間為3 min，再于室溫下洗滌5 s，干燥；將15 μl DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域，蓋片，置于暗處10～20 min，熒光顯微鏡下觀察。③結(jié)果判定：以橘紅色HER2/neu基因熒光信號(hào)和綠色熒光信號(hào)數(shù)目比值作為判讀標(biāo)準(zhǔn)，共計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞，當(dāng)紅色熒光信號(hào)/綠色熒光信號(hào)比值<1.8為基因無擴(kuò)增，記為陰性；當(dāng)比值>2.2或眾多紅色熒光信號(hào)連接成簇或團(tuán)為基因擴(kuò)增，記為陽性；比值位于1.8～2.2之間時(shí)增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè)后再次進(jìn)行判斷。

1.2.6免疫組織化學(xué)檢測[8]：石蠟切片并于65 ℃條件下烤片，脫蠟至水，用pH值7.4的PBS沖洗3次，每次3 min，枸櫞酸鹽緩沖液(pH值6.0)加熱修復(fù)10 min，用PBS沖洗2次，每次3 min；用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，滴加聚合物增強(qiáng)劑于室溫下孵育20 min，用PBS沖洗3次，每次3 min；滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物試劑，室溫下孵育30 min，用PBS沖洗5次，每次3 min；滴加DAB液，顯微鏡下觀察6 min，蘇木精復(fù)染，用0.1% HCl分化，沖洗，藍(lán)化，乙醇脫水干燥，二甲苯透明，樹膠封固，晾干觀察。結(jié)果判定：HER2蛋白陽性位于細(xì)胞膜，呈棕褐色，無反應(yīng)或腫瘤細(xì)胞膜染色<10%為“-”；細(xì)胞膜不完整染色≥10%為“+”；較弱的完整細(xì)胞膜染色≥10%為“++”；較強(qiáng)的完整細(xì)胞膜染色>10%為“+++”；其中“-”和“+”為無表達(dá)，記為陰性，“++”和“+++”為過表達(dá)，記為陽性。

2 結(jié)果

2.1兩組基線資料比較 兩組性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度及血紅蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。預(yù)后良好組浸潤深度為T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、白蛋白≤35 g/L、HER2蛋白表達(dá)陽性及HER2/neu基因擴(kuò)增陽性患者占比顯著低于預(yù)后不良組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2影響晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預(yù)后不良的因素 將上述單因素分析中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)因素納入多因素Logistic回歸分析，行量化賦值，因變量為是否發(fā)生不良預(yù)后(是=1，否=0)，自變量為浸潤深度(T4=1，T3=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是=1，否=0)、白蛋白(≤35 g/L=1，>35 g/L=0)、HER2蛋白表達(dá)(陽性=1，陰性=0)、HER2/neu基因擴(kuò)增(陽性=1，陰性=0)。分析結(jié)果顯示，浸潤深度為T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、白蛋白≤35 g/L、HER2蛋白表達(dá)陽性及HER2/neu基因擴(kuò)增陽性是晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)。見表2。

表2 影響晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析

3 討論

HER2是一種原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，其表達(dá)上調(diào)可引起細(xì)胞過度增殖從而促使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，HER2水平在結(jié)直腸癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤組織細(xì)胞中均呈高表達(dá)，基于HER2的分子靶向治療已成為上述惡性腫瘤綜合治療方案的重要組成部分[9-10]。既往研究顯示，HER2在食管腺癌患者中的表達(dá)及病理機(jī)制相關(guān)研究較多[11]，但我國食管癌病理組織學(xué)類型以鱗狀細(xì)胞癌為主，而目前關(guān)于HER2對(duì)食管鱗癌的影響機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好組浸潤深度為T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、白蛋白≤35 g/L、HER2蛋白表達(dá)陽性及HER2/neu基因擴(kuò)增陽性患者占比顯著低于預(yù)后不良組。提示上述因素可能是導(dǎo)致晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。其原因?yàn)槟[瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響食管鱗癌患者生存情況的獨(dú)立影響因素，在多項(xiàng)研究中均已被證實(shí)[12-14]。白蛋白是評(píng)估患者營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)，晚期食管癌患者存在吞咽困難的癥狀，營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足，同時(shí)機(jī)體能量消耗增加，常因營養(yǎng)不良引起免疫功能下降，此時(shí)患者腸黏膜屏障破壞、感染等嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)明顯上升，進(jìn)而引發(fā)不良預(yù)后[15]。

HER2/neu基因是一種受體酪氨酸激酶類原癌基因，屬于表皮生長因子受體家族，其位于人染色體17q21，分子量約為185×103kD，在正常組織中有微弱的表達(dá)，但無HER2/neu基因擴(kuò)增[16]。HER2受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)具有活化的酪氨酸蛋白激酶，自身也存在若干酪氨酸殘基磷酸化位點(diǎn)，其可與特異性生長因子結(jié)合誘導(dǎo)二聚體化并促使受體交叉磷酸化，磷酸化的受體可將細(xì)胞外的生長信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，控制細(xì)胞分裂相關(guān)基因的表達(dá)[17]。HER2/neu基因擴(kuò)增可促使轉(zhuǎn)錄上調(diào)，使HER2蛋白合成量增加，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分裂、凋亡，并上調(diào)血管通透性因子及內(nèi)皮生長因子表達(dá)，進(jìn)而破壞抗體抑制侵襲的保護(hù)屏障，并促使腫瘤組織新生血管生成，使腫瘤細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)[18]。HER2/neu基因擴(kuò)增產(chǎn)物可通過不同信號(hào)傳導(dǎo)通路使細(xì)胞異常增殖并向惡性轉(zhuǎn)化，HER2蛋白表達(dá)上升又在細(xì)胞增殖、分裂、轉(zhuǎn)化、侵襲、黏附中發(fā)揮重要作用[19-20]。因此，HER2蛋白表達(dá)陽性和HER2/neu基因擴(kuò)增陽性常表明腫瘤惡性程度高，侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，此類患者腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)早，預(yù)后較差。

經(jīng)多因素Logistic回歸分析證實(shí)，浸潤深度為T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、白蛋白≤35 g/L、HER2蛋白表達(dá)陽性及HER2/neu基因擴(kuò)增陽性是晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，對(duì)晚期食管鱗癌患者采用含鉑類藥物化療時(shí)應(yīng)對(duì)上述因素予以干預(yù)，以提高患者生存率。

綜上所述，HER2蛋白表達(dá)陽性、HER2基因擴(kuò)增陽性與晚期食管鱗癌患者含鉑類藥物化療預(yù)后具有明顯相關(guān)性，可為臨床制定基于HER2的分子靶向治療方案提供理論依據(jù)。