張國(guó)華，呂思文，金振華，王麗坤，張 瑩，張 備，李 燁，薛沾枚

（1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 116000；2. 齊齊哈爾市龍沙區(qū)農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，黑龍江齊齊哈爾 116000）

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的常見(jiàn)病[1]，可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，影響乳制品品質(zhì)，也可能對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成不良的影響，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。奶牛乳房炎可能由多種因素引起，其中細(xì)菌對(duì)該病的發(fā)生影響很大。引起奶牛乳房炎較為多見(jiàn)的致病菌為大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌等[3]，以金黃色葡萄球菌較為常見(jiàn)。目前，對(duì)奶牛乳房炎多采用常規(guī)的抗生素進(jìn)行治療，極易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致奶牛乳房炎難以治愈。

黑龍江主要養(yǎng)殖的奶牛品種為中國(guó)荷斯坦奶牛、西門(mén)塔爾牛等，奶牛存欄量居全國(guó)前列，且每年保持著較大增幅。乳房炎嚴(yán)重影響本地奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，如何有效治療奶牛乳房炎是畜牧從業(yè)者需要深入研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。為避免出現(xiàn)耐藥性，應(yīng)杜絕盲目使用抗生素，可采用無(wú)抗飼養(yǎng)模式提高奶牛的抵抗力，抵御疾病發(fā)生。若發(fā)生奶牛乳房炎，應(yīng)使用科學(xué)合理的手段對(duì)疾病進(jìn)行診療，確定感染細(xì)菌的種類(lèi)，針對(duì)不同的細(xì)菌精準(zhǔn)用藥可有效治療疾病，降低疾病造成的損失[4]。黑龍江地區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生奶牛產(chǎn)奶量下降、體細(xì)胞數(shù)明顯上升、產(chǎn)奶中帶血等情況。本試驗(yàn)對(duì)該場(chǎng)發(fā)病奶牛的乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，對(duì)分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)、16S rDNA 鑒定、基因序列比對(duì)分析、藥物敏感性試驗(yàn)等，并給出針對(duì)該細(xì)菌的敏感性藥物，指導(dǎo)臨床用藥，為奶牛乳房炎的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集黑龍江地區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)2例乳樣。清洗消毒病牛乳頭，棄去20 mL乳樣，無(wú)菌采集5 mL乳液取回，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。昆明小鼠購(gòu)自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：血平板培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）、革蘭氏染色試劑（北京索萊寶科技有限公司）；藥敏片、細(xì)菌微量生化管（杭州微生物試劑廠），DP302 DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR exTap Master Mix（大連寶生物工程有限公司）。引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

主要儀器：2720PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）、凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀（北京六一儀器設(shè)備廠）、BHC-1300IIA生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器設(shè)備公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌的分離和培養(yǎng)

將取回的乳液于無(wú)菌環(huán)境下操作，13 000 r/min 離心10 min，取下層沉淀100 μL接種于血平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.2 生化試驗(yàn)

將分離到的細(xì)菌根據(jù)鏡檢結(jié)果進(jìn)行初步判斷，進(jìn)行生化試驗(yàn)確認(rèn)細(xì)菌的種類(lèi)。

1.3.3 16S rDNA鑒定（見(jiàn)表1）

表1 16S rDNA引物Tab.1 16S rDNA primer

提取細(xì)菌DNA，16S rDNA 引物根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行設(shè)計(jì)。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期結(jié)果相符后將膠回收產(chǎn)物送至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果于GENEBANK上進(jìn)行比對(duì)分析。16S rDNA引物見(jiàn)表1。

1.3.4 動(dòng)物試驗(yàn)

采用滅菌的吸頭點(diǎn)取單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，加入5%犢牛血清，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，制備單位濃度為3×108CFU/mL的菌液。

取15只昆明小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)組小鼠腹腔注射菌液0.3 mL/只，每個(gè)菌株注射5 只昆明小鼠。設(shè)置1 個(gè)對(duì)照組注射等量的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，觀察試驗(yàn)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠是否出現(xiàn)死亡或發(fā)病癥狀。對(duì)接種細(xì)菌后發(fā)生感染死亡的小鼠臟器內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定。

1.3.5 藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）（2017）推薦的K-B紙片法進(jìn)行操作實(shí)施[6]。選取丁胺卡那、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、鏈霉素、頭孢噻肟等6 種藥敏片，將細(xì)菌均勻涂布于血平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

將分離得到的兩株菌株命名為HQ-1、HQ-2，分別接種于血平板培養(yǎng)16 h，菌落均呈為光滑、濕潤(rùn)、微微隆起的水珠樣菌落。革蘭氏染色顯示分離株為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)菌呈球狀，單個(gè)或幾個(gè)在一堆、或呈葡萄串狀，可初步判定分離得到的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Biochemical tests results

由表2可知，兩株菌株均能夠發(fā)酵蔗糖、蕈糖、乳糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、葡萄糖；無(wú)法發(fā)酵山梨醇、木糖醇。尿素酶試驗(yàn)、VP、甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性；無(wú)法還原硝酸鹽。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)有氣泡產(chǎn)生，呈陽(yáng)性。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，生化鑒定結(jié)果與金黃色葡萄球菌特性相符，確定兩株分離株均為金黃色葡萄球菌。

2.3 16S rDNA PCR鑒定結(jié)果（見(jiàn)圖1）

圖1 16S rDNA PCR鑒定結(jié)果Fig.1 16S rDNA PCR results

由圖1可知，2株菌株經(jīng)DNA提取、PCR鑒定擴(kuò)增出兩條長(zhǎng)度約1 465 bp 的特異性條帶。將PCR 產(chǎn)物送至庫(kù)美進(jìn)行測(cè)序，序列結(jié)果經(jīng)比對(duì)，與ATCC12600 株（NR_118997）同源性分別為95.56%、96.38%。

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

菌液接種24 h后試驗(yàn)組小鼠全部死亡，對(duì)照組小鼠正常。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟腫大；將試驗(yàn)組小鼠的肝臟于無(wú)菌環(huán)境下采集樣本，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，顯示分離得到的細(xì)菌與原細(xì)菌為同種細(xì)菌；進(jìn)行單菌落DNA提取以及擴(kuò)增、測(cè)序，結(jié)果顯示與原細(xì)菌相同。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

表3 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of isolated strains susceptibility test

結(jié)果根據(jù)CLSI的指導(dǎo)判定為藥物敏感（S）、中等敏感（I）、耐藥（R）[4]。由表2可知，兩株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，均對(duì)丁胺卡那這類(lèi)抗生素有較高的敏感性，對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星中介，對(duì)多西環(huán)素、鏈霉素、頭孢噻肟耐藥。

3 討論

葡萄球菌作為一種環(huán)境中常在菌類(lèi)，由于環(huán)境等因素變化，可能引發(fā)致病性，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的安全均具有一定影響[7]。如奶牛感染葡萄球菌可引起乳房炎等多種疾病，嚴(yán)重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康有序發(fā)展[8-10]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑龍江地區(qū)兩例奶牛乳房炎樣本進(jìn)行分離鑒定，確定引起乳房炎的致病菌為金黃色葡萄球菌，與ATCC12600株（NR_118997）同源性高達(dá)95.56%～96.38%；藥物敏感性試驗(yàn)篩選此菌株敏感性藥物為丁胺卡那，進(jìn)行治療后效果顯著，發(fā)病奶牛癥狀迅速消退。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株多西環(huán)素、鏈霉素、頭孢噻肟耐藥，說(shuō)明HQ-1、HQ-2 株細(xì)菌對(duì)于抗生素已產(chǎn)生了一定耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，若奶牛發(fā)生乳房炎等疾病，應(yīng)查找病因并運(yùn)用現(xiàn)代診療方案對(duì)疾病進(jìn)行精準(zhǔn)的治療和有效的預(yù)防[11]，切忌盲目用藥。盲目用藥可能導(dǎo)致病程加長(zhǎng)[12]、治療效果不佳、經(jīng)濟(jì)損失加重等不良后果。

董志民等[13]在東北地區(qū)3 個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)330 份樣本進(jìn)行檢測(cè)，分離得到表皮葡萄球菌32 株、腐生葡萄球菌34株，所得菌株對(duì)青霉素、苯唑西林和林克霉素的耐藥率較高。劉通等[14]對(duì)黑龍江某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)急性乳房炎樣本進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示，葡萄球菌單獨(dú)感染1例，葡萄球菌和鏈球菌混合感染4例，葡萄球菌和酵母菌混合感染2例，感染葡萄球菌樣本占總樣本數(shù)的70%。張艷等[3]對(duì)黑龍江某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)乳腺炎樣本進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示，分離得到大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和蠟樣芽孢桿菌，所得菌株對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星高度敏感。

因此，葡萄球菌在東北地區(qū)奶牛乳房炎的感染較為多見(jiàn)，且均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。為增加養(yǎng)殖戶的收益，降低奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期進(jìn)行環(huán)境消毒及牛群免疫[15]，保證飼料質(zhì)量且飼喂?fàn)I養(yǎng)全面的飼料[16]。若發(fā)生疾病，應(yīng)運(yùn)用科學(xué)合理的手段進(jìn)行治療，避免長(zhǎng)期使用單一藥物引起耐藥性[17]，為助力養(yǎng)殖業(yè)健康有序的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采集的2 份乳房炎樣本，符合金黃色葡萄球菌的形態(tài)鑒定，鏡檢可見(jiàn)葡萄串狀的球形革蘭氏陽(yáng)性菌。生化試驗(yàn)結(jié)果符合金黃色葡萄球菌生化特性；16S rDNA 序列鑒定擴(kuò)增得到大小為1 465 bp 左右的特異性條帶，與ATCC12600 株（NR_118997）同源性為95.56%、96.38%，確認(rèn)分離株金黃色葡萄球菌HQ-1、HQ-2。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)說(shuō)明兩株細(xì)菌均具有較強(qiáng)的致病性。藥敏結(jié)果顯示，分離株對(duì)丁胺卡那敏感。通過(guò)試驗(yàn)確認(rèn)本次奶牛乳房炎為感染金黃色葡萄球菌引起，為黑龍江地區(qū)奶牛乳房炎的治療做出指導(dǎo)，為未來(lái)奶牛乳房炎的研究提供參考。