王曄愷，陳 位，楊潁輝，吳靜澤，王和平，姚燕珍，鮑舟君

1. 浙江省舟山醫(yī)院檢驗(yàn)中心，舟山 316021；2. 浙江省舟山醫(yī)院骨科，舟山 316021；3. 浙江省舟山醫(yī)院放射診斷中心，舟山 316021

異位骨化（heterotopic ossification，HO）指在正常情況下不具有鈣化性質(zhì)的組織中的骨形成，主要特點(diǎn)是在軟骨組織或肌組織中鈣化骨迅速形成，引起關(guān)節(jié)周圍腫脹、疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙等癥狀，甚至出現(xiàn)周圍神經(jīng)嵌壓和壓迫性潰瘍，常分為進(jìn)行性和創(chuàng)傷性。創(chuàng)傷性異位骨化一般認(rèn)為是在骨折、關(guān)節(jié)置換手術(shù)等較大的創(chuàng)傷后，軟組織損傷出血，在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的綜合作用下的結(jié)果。血清骨成形蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）能通過SMAD1/5/8 信號通路誘導(dǎo)異位骨化生成［1］；不同亞型的BMP在誘導(dǎo)成骨活性，以及各型BMP 缺失后的表現(xiàn)各不相同。目前研究較多的是與韌帶骨化及成骨作用最為緊密的BMP-2、BMP-4、BMP-7。除BMP 外，炎癥因子也能參與骨化的作用，如白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）等在體外也能促進(jìn)黃韌帶細(xì)胞的纖維化和骨化［2］，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β） 中和抗體可減少外傷性小鼠的異位骨形成［3］。目前創(chuàng)傷性異位骨化通常是通過早期癥狀和影像學(xué)隨訪才能發(fā)現(xiàn)［4］，而已經(jīng)有較多文獻(xiàn)報(bào)道BMP 和一些炎癥因子是創(chuàng)傷性異位骨化的風(fēng)險(xiǎn)因素，但是目前仍缺乏一個(gè)綜合性的可應(yīng)用于臨床的早期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測評分系統(tǒng)。為實(shí)現(xiàn)對外傷患者的創(chuàng)傷性異位骨化的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的發(fā)病概率預(yù)測，本研究通過收集外傷患者的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清，檢測BMP 及其他若干相關(guān)因子，同時(shí)通過影像學(xué)檢查隨訪患者結(jié)局，再對各細(xì)胞因子與患者結(jié)局行Cox回歸分析，并通過做列線圖（nomogram）將復(fù)雜的Cox 回歸方程轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵吻铱梢暬膱D形評分系統(tǒng)，使預(yù)測模型的結(jié)果更容易被臨床所接受和使用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年8月—2020年10月于浙江省舟山醫(yī)院骨科或腦外科住院的骨折患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)下可見明顯骨折線，包括單發(fā)和多發(fā)性骨折。②受傷后即刻入院就診。③均進(jìn)行了手術(shù)，包括復(fù)位術(shù)、內(nèi)固定和外固定術(shù)。④知情同意，且自愿參加本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①兒童和青少年。②存在嚴(yán)重的慢性疾病如腫瘤等。③難以完成隨訪者。④術(shù)中進(jìn)行了關(guān)節(jié)置換的患者。共納入患者124例，其中男性81例，女性43 例，年齡25～91 歲，平均年齡（56.48±15.45）歲，主要骨折部位包括股骨（29 例）、脛腓骨（17 例）、肱骨（15 例），其余為髖骨、肩胛骨、尺骨、橈骨、顱骨等。分別于患者骨折入院后1 d、7 d、15 d，收集3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清，-20 ℃凍存。樣本采集已經(jīng)過浙江省舟山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，所有入組患者均簽署知情同意書，倫理審批號2019倫審第（068）號。

1.2 試劑和儀器

BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7 及 細(xì) 胞 因 子IL-4、IL-6、IL-10、γ 干擾素（interferon γ，IFN-γ）、TGF-β的ELISA檢測試劑盒均購自上海紀(jì)寧生物科技有限公司。酶標(biāo)儀為Thermo MK3 型，影像學(xué)檢查CT 機(jī)為東芝Aquilion 64 排螺旋CT 儀，X 射線機(jī)為島津數(shù)字化攝影X線機(jī)。

1.3 臨床治療

通過影像學(xué)檢查等方法對骨折本身進(jìn)行評估，并判斷軟組織損傷程度，根據(jù)相應(yīng)的指征進(jìn)行復(fù)位、內(nèi)固定或外固定手術(shù)治療等。大多數(shù)患者使用曲馬多給予鎮(zhèn)痛，極少數(shù)開放性骨折患者使用頭孢克肟等消炎，用布洛芬和曲馬多聯(lián)合鎮(zhèn)痛。

1.4 臨床指征收集和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測

由臨床醫(yī)師采集患者臨床資料，包括性別、年齡、是否合并腦外傷等，并從手術(shù)記錄單上采集麻醉方式、手術(shù)持續(xù)時(shí)間、術(shù)中出血量等。其中麻醉方式包括全身麻醉、靜吸復(fù)合麻醉、局部浸潤麻醉、蛛網(wǎng)膜下腔阻滯、臂叢神經(jīng)阻滯、硬膜外腔阻滯，將蛛網(wǎng)膜下腔阻滯和硬膜外腔阻滯定義為可能影響脊髓的麻醉方式。BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7 及細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TGF-β 的濃度采用ELISA試劑盒檢測。通過對倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值建立線性回歸換算得到各樣本的檢測物濃度。

1.5 影像學(xué)隨訪

對骨折后的患者進(jìn)行影像學(xué)隨訪（3個(gè)月內(nèi)1～3周一次，3 個(gè)月后3～6 個(gè)月一次），方式為X 片和/或CT，檢查部位包括原發(fā)性骨折部位及患者自述不適的其他部位，對患者異位骨化的診斷由放射診斷中心2 名副主任醫(yī)師共同確認(rèn)。根據(jù)是否發(fā)生異位骨化，將研究對象分為可見HO組和未見HO組。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料先通過K-S 檢驗(yàn)判斷正態(tài)性，正態(tài)資料用±s表示并采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，偏態(tài)資料用M（P25，P75）表示并采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)。定性資料采用χ2檢驗(yàn)（1≤T<5采用校正χ2檢驗(yàn)，T<1或n<40采用Fisher精確概率法）。以α=0.15 從組間比較中挑選變量納入單變量COX 回歸模型，再以α=0.05從單變量COX 回歸模型中挑選變量納入多變量COX 回歸模型以篩選患者發(fā)生HO 的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)率（HR）及95%CI。最后通過R 語言中的rms 包進(jìn)行nomogram可視化輸出。用Bootstrap 內(nèi)部抽樣驗(yàn)證計(jì)算C 指數(shù)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

124 例隨訪患者隨訪13～660 d，中位時(shí)間為139（65，347）d，共發(fā)現(xiàn)13 例發(fā)生異位骨化。隨訪發(fā)現(xiàn)異位骨化的時(shí)間為71（38，292）d，其中髖關(guān)節(jié)附近8 例，膝關(guān)節(jié)附近3 例，踝關(guān)節(jié)附近1 例，鎖骨附近1例（圖1）。

圖1 部分患者異位骨化的影像學(xué)表現(xiàn)（X光片）Fig 1 X-rays of heterotopic ossification in some patients

2.2 可見與未見HO組的一般情況和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

由表1 可見，一般情況中，可見HO 組中的合并腦外傷（包括頭皮損傷、顱骨損傷與腦損傷）比例（46.15%）高于未見HO 組（12.61%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。BMP 中，可見HO 組的BMP-2、BMP-4 在1 d、7 d、15 d 各時(shí)間點(diǎn)的濃度均高于未見HO 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）；可見HO組的BMP-5和BMP-7僅在入院后1 d的濃度高于未見HO 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。細(xì)胞因子中，可見HO 組的IL-6 和TGF-β 在1 d、7 d、15 d各時(shí)間點(diǎn)的濃度均高于未見HO 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。

表1 可見HO組和未見HO組患者的臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較Tab 1 Comparison of clinical and laboratory indicators between HO group and non-HO group

2.3 異位骨化結(jié)局的Cox回歸分析

以α=0.15的標(biāo)準(zhǔn)從表1中選擇年齡、合并腦外傷、手術(shù)持續(xù)時(shí)間、術(shù)中出血量、BMP-2（1 d）、BMP-2（7 d）、BMP-2（15 d）、BMP-4（1 d）、BMP-4（7 d）、BMP-4（15 d）、BMP-5（1 d）、BMP-7（1 d）、BMP-7（7 d）、BMP-7（15 d）、IL-6（1 d）、IL-6（7 d）、IL-6（15 d）、IFN-γ（1 d）、IL-4（7 d）、TGF-β（1 d）、TGF-β（7 d）、TGF-β（15 d）共22個(gè)變量納入單因素Cox回歸模型進(jìn)行分析，得到合并腦外傷、手術(shù)持續(xù)時(shí)間、術(shù)中 出 血 量、BMP-2（1 d）、BMP-2（7 d）、BMP-2（15 d）、BMP-4（1 d）、BMP-4（7 d）、BMP-4（15 d）、BMP-7（1 d）、BMP-7（7 d）、IL-6（1 d）、IL-6（7 d）、IL-6（15 d）、IFN-γ（1 d）、TGF-β（1 d）、TGF-β（7 d）、TGF-β（15 d）共18個(gè)指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將這18個(gè)指標(biāo)納入多因素Cox回歸模型進(jìn)行分析，最終得到合并腦外傷（HR=2.932）、手術(shù)持續(xù)時(shí)間（HR=1.005）、術(shù)中出血量（HR=1.004）、BMP-2（15 d）（HR=1.009）、BMP-4（15 d）（HR=1.004）、 BMP-7（7 d）（HR=1.004）、TGF-β（15 d）（HR=1.011）共7 個(gè)對HO 結(jié)局有顯著影響的因子（R2=0.852）。詳見表2。

表2 骨折后手術(shù)患者異位骨化結(jié)局的單因素和多因素Cox回歸分析Tab 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of heterotopic ossification outcome in the patients with fracture undergoing operation

2.4 異位骨化結(jié)局的nomogram模型輸出

通過R 程序中的rms 包輸出nomogram 模型（圖2），并設(shè)定90 d、180 d、360 d 3 個(gè)預(yù)測時(shí)間節(jié)點(diǎn)，預(yù)測骨折患者接受手術(shù)治療后發(fā)生異位骨化的可能性，3 個(gè)節(jié)點(diǎn)的C 指數(shù)分別為0.916、0.923、0.904。

圖2 骨折后手術(shù)患者骨折后90 d、180 d、360 d發(fā)生異位骨化概率的nomogramFig 2 Nomogram for predicting morbidity of HO 90 d,180 d and 360 d after fracture

3 討論

創(chuàng)傷性異位骨化是人體修復(fù)的一種特殊形式，但在髖關(guān)節(jié)置換這類創(chuàng)傷性較大的手術(shù)中，過度骨化對恢復(fù)期的關(guān)節(jié)活動(dòng)度會(huì)產(chǎn)生不良影響［5］。目前認(rèn)為異位骨化存在較多影響因素，通常認(rèn)為性別是異位骨化的影響因素之一［6-7］。但本研究中性別卻并非顯著影響因子，可能由于本研究與文獻(xiàn)中納入的患者類別不同的原因：文獻(xiàn)中均為髖關(guān)節(jié)置換患者［6-7］，而本研究中為各類骨折和腦外傷患者。手術(shù)麻醉方式是否為異位骨化的顯著影響因素目前尚存在爭議［8］，但隨著對麻醉機(jī)制認(rèn)識(shí)的加深，發(fā)現(xiàn)異位骨化可能并非只與硬膜外麻醉時(shí)的肌肉張力增加有關(guān)，還可能是在麻醉時(shí)對脊髓的潛在損傷引起了神經(jīng)源性的異位骨化。神經(jīng)源性的異位骨化主要由腦外傷及脊髓損傷引發(fā)，進(jìn)而造成機(jī)體的液體環(huán)境、細(xì)胞因子等的變化，通過“細(xì)胞因子風(fēng)暴”這類級聯(lián)放大反應(yīng)加大了異位骨化的發(fā)生率；而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［9］也表明TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子在創(chuàng)傷性和遺傳性異位骨化的部分時(shí)間節(jié)點(diǎn)存在差異。本研究中麻醉方式并非異位骨化的顯著影響因子，可能是因?yàn)槁樽矸绞降挠绊戇€與麻醉醫(yī)師的穿刺熟練程度有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)手術(shù)持續(xù)時(shí)間和出血量的增加是異位骨化的2 項(xiàng)危險(xiǎn)因子，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道相符。而HAYASHI 等［10］認(rèn)為除了手術(shù)持續(xù)時(shí)間以外，從創(chuàng)傷發(fā)生至手術(shù)的間隔時(shí)間的增加也會(huì)帶來骨盆或股骨近端異位骨化風(fēng)險(xiǎn)的增加。這些證據(jù)都表明：神經(jīng)和肌肉損傷程度對異位骨化也有一定影響［11］，因此在骨科的臨床工作中，減少骨折至手術(shù)的時(shí)間及減少手術(shù)持續(xù)時(shí)間對早期異位骨化的預(yù)防具有重要意義。

內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及成骨分化被認(rèn)為是發(fā)生異位骨化的關(guān)鍵過程。BMP/SMAD 通路激活是間充質(zhì)細(xì)胞或成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志之一，抑制BMP/SMAD 通路有助于抑制骨化作用，如應(yīng)用BMP Ⅰ型受體抑制劑可阻斷成骨分化和SMAD 磷酸化的激活［12］。本研究表明相對于骨折初期，骨折后7～15 d 的BMP 濃度對后續(xù)異位骨化的形成具有更重要的參考價(jià)值；體外實(shí)驗(yàn)［11］也表明一些抗炎藥物在通過降低體內(nèi)炎癥反應(yīng)抑制異位骨化形成的同時(shí)也能降低BMP-7 的表達(dá)。炎癥因子中以TGF-β 作用更明顯，這可能是因?yàn)镮L-6、IL-4 等細(xì)胞因子半衰期較短，無法持久地發(fā)揮成骨作用，而TGF-β 和BMP 均屬于TGF-β 超家族，可通過依賴和非依賴SMAD 通路發(fā)揮作用，血清中的維持時(shí)間和效果明顯強(qiáng)于其他細(xì)胞因子。通過對一些髖關(guān)節(jié)假體置換后形成的異位骨化組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果分析也證實(shí)了這點(diǎn)：早期異位骨化組織未成熟時(shí)TGF-β 增長極快，隨著異位骨化組織的逐漸成熟，TGF-β 表達(dá)水平持續(xù)升高，直至2 年后隨著異位骨化組織形成減慢才逐漸停止［13］。對異位骨化的預(yù)防研究也主要集中在針對性抑制BMP 和TGF-β 的作用上，如全身注射TGF-β 中和抗體可減弱外傷性和BMP 誘導(dǎo)的小鼠異位骨化模型以及骨化纖維發(fā)育不良進(jìn)展小鼠模型中的異位骨形成［3］；地氯雷他定可通過抑制BMP2/SMAD1/5/8 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而抑制血小板衍生生長因子受體α（platelet derived growth factor receptor α，PDGFRα）陽性細(xì)胞的成骨分化，從而抑制異位骨化的生成［1］。當(dāng)然，異位骨化結(jié)局是由破骨和成骨作用平衡協(xié)調(diào)的產(chǎn)物，而破骨細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、金屬基質(zhì)蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）在異位骨化中也起到重要作用，也能作為異位骨化的預(yù)測標(biāo)志物；但相關(guān)報(bào)道多集中在組織表達(dá)上，關(guān)于它們在血清中表達(dá)的報(bào)道并不多，在后續(xù)的研究中我們會(huì)繼續(xù)關(guān)注這類蛋白。

Nomogram 圖是一種將回歸結(jié)果進(jìn)行可視化輸出的方法，它根據(jù)所有自變量回歸系數(shù)的大小來制定評分標(biāo)準(zhǔn)，對患者的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分值累積就可計(jì)算得到一個(gè)總分，再通過得分與結(jié)局發(fā)生概率之間的轉(zhuǎn)換函數(shù)來計(jì)算每個(gè)患者的結(jié)局發(fā)生概率。臨床上常用的Logistic 模型只有結(jié)局變量而無時(shí)間變量，如遇到對時(shí)間結(jié)局相關(guān)的預(yù)測要求則無法實(shí)現(xiàn)。WANG 等［14］通過Cox 回歸模型解決了上述問題，預(yù)測得到了多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的患者存活概率，并用nomogram 圖進(jìn)行了可視化輸出。本研究建立的nomogram 預(yù)測模型可初步應(yīng)用于臨床上對骨折患者的異位骨化風(fēng)險(xiǎn)評估。如果相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的異位骨化發(fā)生概率升高，則可進(jìn)行提前干預(yù)，通過物理和藥物治療等，進(jìn)一步降低患者異位骨化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)然本研究也存在一定的局限性，如我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同品牌的BMP 及細(xì)胞因子ELISA 試劑盒檢測結(jié)果存在數(shù)值上的偏差。如何對數(shù)值進(jìn)行標(biāo)化處理以使預(yù)測結(jié)果更加符合真實(shí)的異位骨化發(fā)生概率，是以后著重需要解決的問題。