陳金梅 姚婷 陳小華

2007年，Yamanaka團(tuán)隊(duì)通過四種轉(zhuǎn)錄因子(Oc4、Sox2、Klf4和c-Myc)將人類真皮成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)，從而開啟了一個(gè)醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的新時(shí)代。iPSC具備干細(xì)胞的自我更新和多能分化特征，在一定條件下可以分化成多種細(xì)胞譜系，重現(xiàn)細(xì)胞發(fā)育的生物信息，反映人類疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，用來預(yù)測(cè)藥物對(duì)人體的靶器官毒性和作用機(jī)制，在藥物篩選方面具有廣泛的應(yīng)用前景。2009年，Song等通過模擬人體的肝臟胚胎發(fā)育過程，首次將人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞(HLC)，并且在肝細(xì)胞標(biāo)志物和功能的表達(dá)上與hESC來源肝細(xì)胞相當(dāng)[1]。在小鼠模型中，hiHEP具有在體內(nèi)整合到肝實(shí)質(zhì)的能力，使其成為再生醫(yī)學(xué)的潛在來源[2]。

iPSC可從成體細(xì)胞直接誘導(dǎo)而成，避免破壞胚胎所引起的倫理問題，完全不受來源限制，同時(shí)iPSC具有與其來源相同的遺傳背景，極大地解決了免疫排斥問題。但干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞分化效率低、誘導(dǎo)過程復(fù)雜、費(fèi)用昂貴、致瘤性及免疫原性，極大地限制了其在臨床和科研實(shí)踐中的應(yīng)用。

一、分化方案

(一)外源誘導(dǎo)劑 總體上，分化原則是模擬肝臟的胚胎發(fā)育，使細(xì)胞分化遵循自然發(fā)展途徑。最初是以時(shí)間依賴的方式使用不同的生長(zhǎng)因子作為調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的發(fā)育信號(hào)，如激活素-A、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和腫瘤抑制素-M(OSM)等，但分化而來的細(xì)胞通常表達(dá)不成熟的肝臟細(xì)胞表型(即表達(dá)早期標(biāo)志物以及低水平的成熟肝臟細(xì)胞標(biāo)志物和細(xì)胞色素P450活性[3])。

干細(xì)胞的肝臟分化主要分成三個(gè)階段：定形內(nèi)胚層、肝祖細(xì)胞形成、類肝細(xì)胞成熟。干細(xì)胞的多能狀態(tài)由TGF-β/Activin/Nodal和FGF信號(hào)通路維持。一方面FGF和Activin A刺激PI3-K /GSK3β信號(hào)上調(diào)多能基因NANOG的表達(dá)，維持iPSC的未分化狀態(tài)[4]。另一方面激活素-A與nodal受體結(jié)合，模擬nodal信號(hào)誘導(dǎo)內(nèi)胚層分化[5]。體外實(shí)驗(yàn)中，在BMP4和其他PI3K抑制劑的輔助下，高劑量的激活素A能夠抑制多能基因的表達(dá)并成為內(nèi)胚層分化的誘導(dǎo)信號(hào)[6]。同時(shí)，有研究者發(fā)現(xiàn)在激活素存在的情況下，內(nèi)胚層可以繼續(xù)發(fā)育為肝祖細(xì)胞[5]。BMP與激活素A同是TGF-β家族成員，在胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖和分化中起著重要的作用[7]。其中BMP4、BMP10是分化中常用的細(xì)胞因子，以Smad和MAPK信號(hào)途徑介導(dǎo)中胚層和內(nèi)胚層的產(chǎn)生[8]。肝譜系成熟通常使用HGF和OSM，前者在體內(nèi)由非實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，是促進(jìn)肝再生的重要因子[9]。而OSM通過激活STAT3信號(hào)促進(jìn)肝細(xì)胞的發(fā)育成熟[10]。

生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴，在一定程度上限制了大規(guī)模誘導(dǎo)的開展。一些相對(duì)低價(jià)且有效的小分子物質(zhì)(SMs)引起人們的關(guān)注。糖原合成酶激酶(GSK)-3抑制劑CHIR99021、磷酸肌醇3-激酶(PI3Ks)抑制劑LY294002、HGF受體激動(dòng)劑N-己酰基-Ile-(6)氨基己酰胺和CYP3A誘導(dǎo)劑(地塞米松)分別被用于定形內(nèi)胚層分化、肝祖細(xì)胞形成和肝細(xì)胞成熟。有學(xué)者通過SMs成功分化出hiHEPs，并且hiHEPs在總體基因和肝標(biāo)志物表達(dá)方面與生長(zhǎng)因子分化的肝臟細(xì)胞相似[11]。與其他方法相比，基于小分子的肝臟細(xì)胞分化方案具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、安全和可重復(fù)性的優(yōu)勢(shì)。

(二)培養(yǎng)條件 隨著對(duì)肝臟分化的研究不斷深入，有學(xué)者將干細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)共同培養(yǎng)產(chǎn)生表型上更接近成人的肝臟細(xì)胞[12, 13]。嘗試使用不同的天然或合成的支架維持細(xì)胞分化的三維空間結(jié)構(gòu)，肝臟細(xì)胞可在該結(jié)構(gòu)中誘導(dǎo)生長(zhǎng)，同時(shí)可再現(xiàn)真實(shí)的細(xì)胞外基質(zhì)條件，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和其他因素的輸送。目前已經(jīng)開發(fā)了多種可降解生物相容性支架材料，包括天然(膠原蛋白、明膠、等)、合成(聚乳酸、聚乙二醇和聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)等)材料[14]。一些納米材料，包括水凝膠纖維[15]、3D可灌注芯片系統(tǒng)[16]、石墨烯基3D支架[14]、電紡納米纖維[17]等因其優(yōu)越的理化性質(zhì)(孔徑、硬度、彈性、導(dǎo)電性)也被用作細(xì)胞的支架，最大程度地降低對(duì)細(xì)胞的潛在危害。細(xì)胞外基質(zhì)成分是理想的支架材料，肝臟脫細(xì)胞生物支架的出現(xiàn)保留了完整的血管網(wǎng)絡(luò)和天然的細(xì)胞外基質(zhì)[18]，比人工合成的支架有更大的優(yōu)勢(shì)，為組織工程肝臟的研究帶來新的方向。

肝臟組織工程研究日新月異，細(xì)胞和支架的結(jié)合開啟了將多種器官特異性細(xì)胞類型整合到單一結(jié)構(gòu)器官的時(shí)代，重現(xiàn)人類肝臟的生理和微觀解剖結(jié)構(gòu)，即所謂的類器官。2001年Michalopoulos等采用成年大鼠的肝臟細(xì)胞經(jīng)膠原酶分離后維持在肝細(xì)胞培養(yǎng)基與生長(zhǎng)因子中，經(jīng)歷一系列復(fù)雜的變化后，最終產(chǎn)生具有膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)[19]。Takebe等利用iPSC來源肝細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞在基質(zhì)膠涂板層上共培養(yǎng)，產(chǎn)生最初的iPSC源性肝細(xì)胞類器官[20]。Guan利用iPSC產(chǎn)生具有肝膽結(jié)構(gòu)的肝類器官[21]。比起傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)，肝臟類器官增加了體外肝臟培養(yǎng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，彌補(bǔ)體外細(xì)胞培養(yǎng)和真實(shí)組織之間的差距，并可長(zhǎng)期擴(kuò)增、冷凍保存。更為重要的是，在動(dòng)物試驗(yàn)中類器官實(shí)現(xiàn)了血液循環(huán)和功能表達(dá)的統(tǒng)一。

三、應(yīng)用前景

雖然iPSC具體的誘導(dǎo)分化方案依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蛘邨l件有所不同，但其終極目標(biāo)都是產(chǎn)生具備相應(yīng)結(jié)構(gòu)和功能的肝臟細(xì)胞并應(yīng)用于臨床，以探索疾病的發(fā)病機(jī)制及潛在的治療方案(圖1)。

圖1 hiHEP的分化過程及應(yīng)用

(一)藥理學(xué)研究 hiHEP具有細(xì)胞色素P450活性，適用于研究藥物代謝和藥物毒性檢測(cè)。一方面，由于iPSC的遺傳特異性，hiHEP可以研究肝臟藥物代謝能力和藥物反應(yīng)個(gè)體間差異[22]。另一方面，hiHEP評(píng)估藥物對(duì)肝細(xì)胞形態(tài)和生存能力的影響，在進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前可發(fā)現(xiàn)潛在的肝毒性，從而提高藥物開發(fā)效率[23]。

(二)細(xì)胞治療 肝細(xì)胞移植是目前終末期肝病的有效治療手段，但肝細(xì)胞來源有限、分離細(xì)胞質(zhì)量差和免疫排斥反應(yīng)限制了它的應(yīng)用。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有研究人員已提出使用來源于hPSC的細(xì)胞再生替代受損組織，以實(shí)現(xiàn)功能恢復(fù)。hiPSCs尤其具有產(chǎn)生分化的患者特異性細(xì)胞、允許自體細(xì)胞移植以及理論上減少免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)的重要優(yōu)勢(shì)。2014年對(duì)一名患有滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的日本婦女進(jìn)行了第一次基于iPSC細(xì)胞療法的人體臨床試驗(yàn)，該患者右眼被植入了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)片，術(shù)后1年右眼的最佳矯正視力在沒有接受常規(guī)治療的情況下未改善也沒有惡化，且2年內(nèi)沒有發(fā)生免疫排斥等嚴(yán)重不良反應(yīng)[24]。2018年，程剛等利用hiHEP治療肝纖維化大鼠，移植后4周大鼠肝損傷程度及肝功能有明顯改善[25]。最近的臨床前研究表明，hiHEP移植也改善了遺傳性肝病和ALF的預(yù)后[26, 27]。隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，人們通過使用核酸酶和成簇的有規(guī)律間隔的CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行修飾和校正，而iPSC技術(shù)和基因編輯技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用為一些單基因遺傳代謝性肝病的“基因矯正”提供了希望[21, 28]。

(三) 體外疾病模型 疾病建模是另一個(gè)重要的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。來源于不同患者的特異性iPSC分化為功能成熟的肝臟細(xì)胞，可構(gòu)建遺傳性肝病模型，如AAT病[29]、家族性高膽固醇血癥[30]、糖原貯積病1a型[31]、Wilson病(ATP7B缺乏)[32]、家族性甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣變性[33]等，模擬疾病的病理過程，為藥物研發(fā)尋找新的思路。

hiHEP也廣泛應(yīng)用于嗜肝病毒感染中。使用人類多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化HLC，能夠表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記物和對(duì)乙肝病毒(HBV)感染重要的宿主因子，再現(xiàn)病毒的生命周期和病毒誘導(dǎo)的肝功能障礙[34-36]。hiHEP同樣表達(dá)已知的參與丙肝病毒(HCV)進(jìn)入的丙肝病毒宿主受體(Claudin-1、Occludin、SR-BI、CD81)，并支持丙肝病毒基因型2a長(zhǎng)達(dá)21天的完整生命周期[37]。戊肝病毒(HEV)[38]、寨卡病毒(ZIKV)[39]感染的肝臟模型也已經(jīng)開發(fā)出來。同時(shí)來自不同供體的iPSC是個(gè)體化肝炎研究與治療的可靠模型。經(jīng)脂肪酸處理過的hiHEP可以誘導(dǎo)出非酒精性脂肪肝表型，從而鑒定肝脂肪變性相關(guān)的肝標(biāo)記物和調(diào)節(jié)通路[40]。

四、總結(jié)與展望

盡管iPSC為肝臟疾病帶來了新曙光，但目前的分化方案衍生出的HLC仍然與人類成熟肝細(xì)胞有一定差距。同時(shí)iPSCs中檢測(cè)到的基因組易位將產(chǎn)生融合蛋白和新的免疫原性決定簇，直接或間接促進(jìn)體內(nèi)免疫原性和致瘤性，引發(fā)安全問題[41]。盡管種種限制，我們?nèi)孕枰弑M全力尋找新的方案，將干細(xì)胞分化為具有表型穩(wěn)定性且無致瘤風(fēng)險(xiǎn)的功能性和可移植性細(xì)胞。相信隨著分化技術(shù)及材料的進(jìn)一步發(fā)展與成熟，hiHEP勢(shì)必將在臨床應(yīng)用上取得更大的突破。