常麗仙 劉春云 謝翩

肝細胞癌術(shù)后較高的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率一直是影響遠期療效的關(guān)鍵因素，故早期預(yù)測肝細胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，并制定出合理的干預(yù)手段，對改善患者遠期預(yù)后意義重大[1]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷為原發(fā)性肝細胞癌早干預(yù)的關(guān)鍵，但諸多患者就診時已延誤了治療最佳時機，且肝細胞癌侵襲性高，預(yù)后較差，故研究肝細胞癌的發(fā)病機制，找到幫助臨床早期診斷的標志性生物學(xué)指標迫在眉睫[2-3]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3(phosphatidylinositol proteoglycan 3，GPC3)是乙酰肝素硫酸蛋白聚糖家族一員，在人類胚胎中廣泛表達，GPC3可通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素生長因子等調(diào)控胚胎生長、形態(tài)改變[4-5]。本研究通過觀察肝細胞癌組織中GPC3表達與肝細胞癌惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，已期指導(dǎo)早期診斷與治療。

資料與方法

一、納入對象與基線資料

回顧性分析2017年12月至2020年8月昆明市第三人民醫(yī)院就診的77例肝細胞癌患者的臨床資料，其中男性55例，女性22例；年齡為(36.6±5.1)歲。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期42例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例；病灶直徑<5 cm 38例，≥5 cm 39例。肝功能Child-Pugh[5]評級：A級40例，B級37例。納入條件：①診斷符合《肝細胞癌外科治療方法的選擇專家共識(2016年第3次修訂)》[6]中相關(guān)標準；②患者均經(jīng)臨床病理確診為肝細胞癌；③預(yù)計生存時間超過半年；④患者臨床資料無缺失。排除條件：①術(shù)前接受放化療；②合并活動性感染且抗感染效果不理想；③凝血功能異常；④伴血液性疾病患者；⑤因藥物引起脂肪肝、酒精性肝病等肝病者；⑧合并其他部位惡病質(zhì)者。本研究涉及的有關(guān)倫理問題均按照倫理委員會規(guī)定，且均取得患者及家屬的同意。

二、標本采集

肝細胞癌標本取自于肝細胞癌原發(fā)病灶處，癌旁組織取自于距離原發(fā)病灶5 cm的癌旁肝組織，正常肝組織取自于距離肝細胞癌原發(fā)病灶5 cm外的肝組織，且經(jīng)病理學(xué)檢查為正常肝組織。所有組織來源均在術(shù)中離體30 min內(nèi)完成取材，在此過程中應(yīng)用的醫(yī)療器械、標本管均經(jīng)去RNA酶水浸泡后使用。

三、 方法

(一)儀器及試劑 兔抗人Ebpl單克隆抗體(美國abeam公司)、鼠抗人GPC-3單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、免疫組化試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、DAB顯色試劑盒(福州巧新生物技術(shù)公司)、PBS緩沖液粉劑(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、枸櫞酸緩沖液粉劑(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、RM2255全自動切片機(德國leica公司)、單道微量可調(diào)節(jié)加樣器(Biohit芬蘭百得公司)、D21-CB圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)、切片沖洗烘溫控儀(安徽儀器有限公司)。

(二)免疫組化染色結(jié)果判定標準 參照張晶晶等[7]的免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標準，胞質(zhì)內(nèi)黃色顆粒為陽性細胞。采用半定量計分法判斷，隨機選取5個高倍鏡視野，0分：視野內(nèi)陽性細胞≤5%(陰性)，1分：6%～25%(陰性)，2分：26%～50%(弱陽性)，3分：51%～75%(陽性)，4分：≥76%(強陽性)。染色顆粒顏色：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終得分=細胞內(nèi)染色強度分值*細胞陽性率分值。

(三)癌細胞惡性生物學(xué)行為 采用熒光定量PCR檢測組織中與增殖、侵襲及自噬基因相關(guān)生物學(xué)指標的表達。增殖基因包括：沉默信息調(diào)節(jié)因子6(silent information regulator 6，SIRT6)、叉頭框P2(fork head box P2，F(xiàn)OXP2)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1 α，HIF-1α)。肝細胞凋亡相關(guān)因子包括：磷脂肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteine containing aspartate proteolytic enzyme 3，caspase-3)、絲蘇氨酸蛋白激酶(serine threonine protein kinase，Akt)。細胞吸光度值、細胞增殖及遷移細胞數(shù)量均參照文獻[8]。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、 各組織中GPC3的表達情況

肝細胞癌組織中GPC3陽性表達率為98.70%(76/77)，癌旁組織89.61%(69/77)，正常組織為2.60%(2/77)，各組織中GPC3陽性表達臨床比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=275.074，P<0.01)，其中正常肝組織GPC3陽性表達率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.421，P=0.004)；正常肝組織GPC3陽性表達率低于肝細胞癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.645，P<0.01)；見表1。各組織中S100A2表達分級比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=6.839，P<0.01)。

表1 77例肝細胞癌患者各組織中GPC3的表達情況[份(%)]

二、不同組織中癌細胞惡性生物學(xué)指標與組織中GPC3表達情況

與癌旁組織相比，肝細胞癌組織中GPC3分值、FOXP2、HIF-1α、SIRT6、PI3K、caspase-3、Akt表達均較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。見表2。

表2 77例肝細胞癌患者不同組織中癌細胞惡性生物學(xué)指標與GPC3表達情況(±s)

三、肝細胞癌組織中GPC3表達與癌細胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的相關(guān)性

經(jīng)雙變量Pearson直線相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中GPC3表達與癌細胞惡性生物學(xué)行為(增殖基因：SIRT6、FOXP、HIF-1α；肝細胞凋亡相關(guān)因子：PI3K、caspase-3、Akt)表達均呈正相關(guān)(r>0，均P<0.05)。見表3。

表3 肝細胞癌組織中GPC3表達與癌細胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的相關(guān)性

討 論

肝細胞癌是臨床惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤之一，即便臨床現(xiàn)階段各種放化療的手段不斷更新、完善，肝細胞癌的病死率仍居高不下。

現(xiàn)階段臨床針對肝細胞癌的診斷還局限于血清甲胎蛋白的表達，但針對肝細胞癌的研究，已經(jīng)從單一、多種血清聯(lián)合診斷逐漸向肝細胞癌體外生長機制與功能的擴展，聯(lián)合多種生物學(xué)指標的診斷在提高肝細胞癌早期檢出率與準確度方面是必然趨勢[9]。硫酸乙酰肝素蛋白多糖是一類蛋白，具有單條或多條疏酸乙酸肝素鏈，GPC3蛋白是硫酸乙酰肝素類蛋白聚糖眾多成員中的一員，不同時期，其在機體內(nèi)的分布存在顯著差異，胎兒時期GPC3主要表達于肝臟，成年時期在乳腺、胎盤、卵巢、腎臟、肺臟中弱表達，但在肝臟及其他組織中幾乎不表達，且成人時期GPC3表達與惡病質(zhì)的發(fā)展密切相關(guān)，如卵巢癌、乳腺癌中表達缺失，但在肝癌中呈高表達[10-11]。GPC3是由核心蛋白與糖胺聚糖組成，能夠與肝素結(jié)合型蛋白結(jié)合，并介導(dǎo)細胞的生長、增殖。GPC3介導(dǎo)肝細胞癌發(fā)生的機制：①GPC3定位在細胞膜上，與Wnt黏附、結(jié)合，形成復(fù)合物，提高Wnt表達，提高Wnt信號傳導(dǎo)通路的活躍度的同時，提高相關(guān)癌基因表達，導(dǎo)致癌細胞增生，誘發(fā)致癌；②通過N末端脯氨酸豐富區(qū)與胰島素樣生長因子及其受體結(jié)合，減少細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的磷酸化，導(dǎo)致肝癌發(fā)生[12-13]。本研究通過對比不同肝組織中GPC3表達情況，結(jié)果顯示，正常肝組織GPC3陽性表達率低于癌旁組織和肝細胞癌組織。提示肝組織GPC3在肝細胞癌中呈高表達，由此考慮肝組織GPC3的表達是否與肝細胞癌的病程進展存在某種聯(lián)系，目前現(xiàn)有的研究結(jié)論尚不可知。

本研究通過進一步分析肝組織GPC3表達與癌細胞惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，肝細胞癌組織中GPC3分值、FOXP2、HIF-1α、SIRT6、PI3K、caspase-3、Akt表達均較高。各類惡病質(zhì)細胞的惡性增殖、凋亡均受相關(guān)基因表達的影響，而相關(guān)基因的表達又可間接反應(yīng)惡病質(zhì)的程度，基因的改變可影響癌細胞的增殖、凋亡，使得細胞凋亡受阻，病程延長[14]。FOXP2可通過介導(dǎo)AKT信號通路來抑制肝細胞增殖，HIF-1α增強癌細胞缺氧耐受力；SIRT6是參與細胞周期促進細胞生長的重要指標[15]。本研究結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中GPC3表達與SIRT6、FOXP、HIF-1α、PI3K、caspase-3、Akt表達均呈正相關(guān)。其原因可能為：①GPC3可抑制成纖維細胞生長，降低肝癌細胞與纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白的黏附作用，提高細胞侵襲與遷移能力；②GPC3激活與肝癌細胞增殖、侵襲密切相關(guān)的整合素信號通道，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，促進肝癌細胞生長；③結(jié)合胰島素生長因子Ⅱ，促進肝細胞持續(xù)增殖，加速細胞惡變[16-17]。因本研究為回顧性分析，在選取癌細胞增殖、凋亡基因時，只選取了部分基因，結(jié)果存在片面性，希在未來開展更多前瞻性、大樣本的研究加以驗證。