常麗仙 劉春云 謝翩

肝細(xì)胞癌術(shù)后較高的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率一直是影響遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵因素，故早期預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，并制定出合理的干預(yù)手段，對(duì)改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后意義重大[1]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷為原發(fā)性肝細(xì)胞癌早干預(yù)的關(guān)鍵，但諸多患者就診時(shí)已延誤了治療最佳時(shí)機(jī)，且肝細(xì)胞癌侵襲性高，預(yù)后較差，故研究肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，找到幫助臨床早期診斷的標(biāo)志性生物學(xué)指標(biāo)迫在眉睫[2-3]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3(phosphatidylinositol proteoglycan 3，GPC3)是乙酰肝素硫酸蛋白聚糖家族一員，在人類(lèi)胚胎中廣泛表達(dá)，GPC3可通過(guò)骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素生長(zhǎng)因子等調(diào)控胚胎生長(zhǎng)、形態(tài)改變[4-5]。本研究通過(guò)觀察肝細(xì)胞癌組織中GPC3表達(dá)與肝細(xì)胞癌惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，已期指導(dǎo)早期診斷與治療。

資料與方法

一、納入對(duì)象與基線資料

回顧性分析2017年12月至2020年8月昆明市第三人民醫(yī)院就診的77例肝細(xì)胞癌患者的臨床資料，其中男性55例，女性22例；年齡為(36.6±5.1)歲。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期42例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例；病灶直徑<5 cm 38例，≥5 cm 39例。肝功能Child-Pugh[5]評(píng)級(jí)：A級(jí)40例，B級(jí)37例。納入條件：①診斷符合《肝細(xì)胞癌外科治療方法的選擇專(zhuān)家共識(shí)(2016年第3次修訂)》[6]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②患者均經(jīng)臨床病理確診為肝細(xì)胞癌；③預(yù)計(jì)生存時(shí)間超過(guò)半年；④患者臨床資料無(wú)缺失。排除條件：①術(shù)前接受放化療；②合并活動(dòng)性感染且抗感染效果不理想；③凝血功能異常；④伴血液性疾病患者；⑤因藥物引起脂肪肝、酒精性肝病等肝病者；⑧合并其他部位惡病質(zhì)者。本研究涉及的有關(guān)倫理問(wèn)題均按照倫理委員會(huì)規(guī)定，且均取得患者及家屬的同意。

二、標(biāo)本采集

肝細(xì)胞癌標(biāo)本取自于肝細(xì)胞癌原發(fā)病灶處，癌旁組織取自于距離原發(fā)病灶5 cm的癌旁肝組織，正常肝組織取自于距離肝細(xì)胞癌原發(fā)病灶5 cm外的肝組織，且經(jīng)病理學(xué)檢查為正常肝組織。所有組織來(lái)源均在術(shù)中離體30 min內(nèi)完成取材，在此過(guò)程中應(yīng)用的醫(yī)療器械、標(biāo)本管均經(jīng)去RNA酶水浸泡后使用。

三、 方法

(一)儀器及試劑 兔抗人Ebpl單克隆抗體(美國(guó)abeam公司)、鼠抗人GPC-3單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、免疫組化試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、DAB顯色試劑盒(福州巧新生物技術(shù)公司)、PBS緩沖液粉劑(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、枸櫞酸緩沖液粉劑(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、RM2255全自動(dòng)切片機(jī)(德國(guó)leica公司)、單道微量可調(diào)節(jié)加樣器(Biohit芬蘭百得公司)、D21-CB圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)、切片沖洗烘溫控儀(安徽儀器有限公司)。

(二)免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參照張晶晶等[7]的免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，胞質(zhì)內(nèi)黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。采用半定量計(jì)分法判斷，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，0分：視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞≤5%(陰性)，1分：6%～25%(陰性)，2分：26%～50%(弱陽(yáng)性)，3分：51%～75%(陽(yáng)性)，4分：≥76%(強(qiáng)陽(yáng)性)。染色顆粒顏色：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終得分=細(xì)胞內(nèi)染色強(qiáng)度分值*細(xì)胞陽(yáng)性率分值。

(三)癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為 采用熒光定量PCR檢測(cè)組織中與增殖、侵襲及自噬基因相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的表達(dá)。增殖基因包括：沉默信息調(diào)節(jié)因子6(silent information regulator 6，SIRT6)、叉頭框P2(fork head box P2，F(xiàn)OXP2)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1 α，HIF-1α)。肝細(xì)胞凋亡相關(guān)因子包括：磷脂肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteine containing aspartate proteolytic enzyme 3，caspase-3)、絲蘇氨酸蛋白激酶(serine threonine protein kinase，Akt)。細(xì)胞吸光度值、細(xì)胞增殖及遷移細(xì)胞數(shù)量均參照文獻(xiàn)[8]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、 各組織中GPC3的表達(dá)情況

肝細(xì)胞癌組織中GPC3陽(yáng)性表達(dá)率為98.70%(76/77)，癌旁組織89.61%(69/77)，正常組織為2.60%(2/77)，各組織中GPC3陽(yáng)性表達(dá)臨床比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=275.074，P<0.01)，其中正常肝組織GPC3陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.421，P=0.004)；正常肝組織GPC3陽(yáng)性表達(dá)率低于肝細(xì)胞癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.645，P<0.01)；見(jiàn)表1。各組織中S100A2表達(dá)分級(jí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.839，P<0.01)。

表1 77例肝細(xì)胞癌患者各組織中GPC3的表達(dá)情況[份(%)]

二、不同組織中癌細(xì)胞惡性生物學(xué)指標(biāo)與組織中GPC3表達(dá)情況

與癌旁組織相比，肝細(xì)胞癌組織中GPC3分值、FOXP2、HIF-1α、SIRT6、PI3K、caspase-3、Akt表達(dá)均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 77例肝細(xì)胞癌患者不同組織中癌細(xì)胞惡性生物學(xué)指標(biāo)與GPC3表達(dá)情況(±s)

三、肝細(xì)胞癌組織中GPC3表達(dá)與癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的相關(guān)性

經(jīng)雙變量Pearson直線相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組織中GPC3表達(dá)與癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為(增殖基因：SIRT6、FOXP、HIF-1α；肝細(xì)胞凋亡相關(guān)因子：PI3K、caspase-3、Akt)表達(dá)均呈正相關(guān)(r>0，均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 肝細(xì)胞癌組織中GPC3表達(dá)與癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的相關(guān)性

討 論

肝細(xì)胞癌是臨床惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤之一，即便臨床現(xiàn)階段各種放化療的手段不斷更新、完善，肝細(xì)胞癌的病死率仍居高不下。

現(xiàn)階段臨床針對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷還局限于血清甲胎蛋白的表達(dá)，但針對(duì)肝細(xì)胞癌的研究，已經(jīng)從單一、多種血清聯(lián)合診斷逐漸向肝細(xì)胞癌體外生長(zhǎng)機(jī)制與功能的擴(kuò)展，聯(lián)合多種生物學(xué)指標(biāo)的診斷在提高肝細(xì)胞癌早期檢出率與準(zhǔn)確度方面是必然趨勢(shì)[9]。硫酸乙酰肝素蛋白多糖是一類(lèi)蛋白，具有單條或多條疏酸乙酸肝素鏈，GPC3蛋白是硫酸乙酰肝素類(lèi)蛋白聚糖眾多成員中的一員，不同時(shí)期，其在機(jī)體內(nèi)的分布存在顯著差異，胎兒時(shí)期GPC3主要表達(dá)于肝臟，成年時(shí)期在乳腺、胎盤(pán)、卵巢、腎臟、肺臟中弱表達(dá)，但在肝臟及其他組織中幾乎不表達(dá)，且成人時(shí)期GPC3表達(dá)與惡病質(zhì)的發(fā)展密切相關(guān)，如卵巢癌、乳腺癌中表達(dá)缺失，但在肝癌中呈高表達(dá)[10-11]。GPC3是由核心蛋白與糖胺聚糖組成，能夠與肝素結(jié)合型蛋白結(jié)合，并介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。GPC3介導(dǎo)肝細(xì)胞癌發(fā)生的機(jī)制：①GPC3定位在細(xì)胞膜上，與Wnt黏附、結(jié)合，形成復(fù)合物，提高Wnt表達(dá)，提高Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的活躍度的同時(shí)，提高相關(guān)癌基因表達(dá)，導(dǎo)致癌細(xì)胞增生，誘發(fā)致癌；②通過(guò)N末端脯氨酸豐富區(qū)與胰島素樣生長(zhǎng)因子及其受體結(jié)合，減少細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的磷酸化，導(dǎo)致肝癌發(fā)生[12-13]。本研究通過(guò)對(duì)比不同肝組織中GPC3表達(dá)情況，結(jié)果顯示，正常肝組織GPC3陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織和肝細(xì)胞癌組織。提示肝組織GPC3在肝細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，由此考慮肝組織GPC3的表達(dá)是否與肝細(xì)胞癌的病程進(jìn)展存在某種聯(lián)系，目前現(xiàn)有的研究結(jié)論尚不可知。

本研究通過(guò)進(jìn)一步分析肝組織GPC3表達(dá)與癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，肝細(xì)胞癌組織中GPC3分值、FOXP2、HIF-1α、SIRT6、PI3K、caspase-3、Akt表達(dá)均較高。各類(lèi)惡病質(zhì)細(xì)胞的惡性增殖、凋亡均受相關(guān)基因表達(dá)的影響，而相關(guān)基因的表達(dá)又可間接反應(yīng)惡病質(zhì)的程度，基因的改變可影響癌細(xì)胞的增殖、凋亡，使得細(xì)胞凋亡受阻，病程延長(zhǎng)[14]。FOXP2可通過(guò)介導(dǎo)AKT信號(hào)通路來(lái)抑制肝細(xì)胞增殖，HIF-1α增強(qiáng)癌細(xì)胞缺氧耐受力；SIRT6是參與細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組織中GPC3表達(dá)與SIRT6、FOXP、HIF-1α、PI3K、caspase-3、Akt表達(dá)均呈正相關(guān)。其原因可能為：①GPC3可抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，降低肝癌細(xì)胞與纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白的黏附作用，提高細(xì)胞侵襲與遷移能力；②GPC3激活與肝癌細(xì)胞增殖、侵襲密切相關(guān)的整合素信號(hào)通道，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)；③結(jié)合胰島素生長(zhǎng)因子Ⅱ，促進(jìn)肝細(xì)胞持續(xù)增殖，加速細(xì)胞惡變[16-17]。因本研究為回顧性分析，在選取癌細(xì)胞增殖、凋亡基因時(shí)，只選取了部分基因，結(jié)果存在片面性，希在未來(lái)開(kāi)展更多前瞻性、大樣本的研究加以驗(yàn)證。