邱萌霞，果秀梅，薛 冰，張澤洋，賈士儒，崔建東

(1. 食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 山東大樹(shù)達(dá)孚特膳食品有限公司，菏澤 274000)

綠原酸(chlorogenic acid，CGA)又稱咖啡酰奎寧酸，是金銀花、杜仲、咖啡、茵陳等許多中草藥的主要活性成分之一，是廣泛存在于各種植物中的苯丙素類化合物[1]．研究[2]發(fā)現(xiàn)綠原酸具有清除自由基、抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及預(yù)防糖尿病、高血脂、肝炎等多種生物活性，在食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3-5]，且近年綠原酸已被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為抗癌藥物[6-7]．

目前綠原酸的主要生產(chǎn)方法主要是通過(guò)超聲波法、水提取法等方法從植物的根、葉、花、果實(shí)中直接進(jìn)行提取，如馬鈴薯皮[8-9]、微藻、紫甘薯[10]、草本植物等[11]．由于中藥植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、資源匱乏，綠原酸含量低以及提取工藝復(fù)雜、成本高等問(wèn)題，導(dǎo)致綠原酸生產(chǎn)效率較低．

植物內(nèi)生菌是生活在健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙，對(duì)植物無(wú)害的一些真菌或細(xì)菌[12].目前從藻類、苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物中均已分離到內(nèi)生菌，具有豐富的生物多樣性[13]．研究[14]表明，內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性成分，是宿主植物活性物質(zhì)的良好替代生產(chǎn)資源．劉洋露等[15]從金銀花中分離得到了合成綠原酸的內(nèi)生細(xì)菌B3．冷慕嬋等[16]以金銀花的不同部位為原材料，采用組織塊法從金銀花中篩選分離出80株具有合成綠原酸能力的內(nèi)生真菌．以上結(jié)果表明，某些中藥植物內(nèi)生菌具有合成綠原酸的能力．

因此，本研究從金銀花葉、紅薯葉、薄荷葉、蒲公英葉和杜仲葉中分離篩選出具有合成綠原酸的內(nèi)生菌，進(jìn)而通過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)高效生產(chǎn)綠原酸．這樣，不僅可以減少對(duì)中藥植物的依賴，而且會(huì)降低綠原酸的生產(chǎn)成本，并將為開(kāi)發(fā)產(chǎn)綠原酸工程菌株以及微生物發(fā)酵生產(chǎn)綠原酸奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料合成綠原酸內(nèi)生菌的植物來(lái)源：金銀花葉、紅薯葉、薄荷葉、蒲公英葉和杜仲葉，市售．

1.1.2 試劑與儀器氫氧化鈉，分析純，博歐特(天津)化工貿(mào)易有限公司；無(wú)水乙醇和乙酸乙酯，分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；甲醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司；氯化鈉和氯化鋁，分析純，天津市四通化工廠；瓊脂粉和牛肉膏，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨，生物試劑，賽默飛世爾科技公司；綠原酸(標(biāo)準(zhǔn)品)，北京索萊寶科技有限公司．

LRH–250–SHE型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；ZHJH–C1115B型生物潔凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX–75L–I型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；VOS–90A型真空干燥箱，上海恰森儀器有限公司；GZX–9070型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DTC–15J型超聲波清洗機(jī)，上海比浪儀器制造有限公司；ZQZY–CS8型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司．

1.2 方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以50%甲醇為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為5、25、50、75、100μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液．

1.2.2 培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨篩選培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，AlCl30.75mmol/L，pH 7.2～7.4，121℃高溫滅菌．

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，121℃高溫滅菌．

單因素優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀 1g/L，磷酸氫二鉀 1g/L，NaCl 1g/L，121℃高溫滅菌．

1.2.3 合成綠原酸內(nèi)生菌的分離與純化

參考Weber等[17]的方法，將新鮮的金銀花葉、紅薯葉、薄荷葉、蒲公英葉和杜仲葉用無(wú)菌水清洗3次，置于超凈工作臺(tái)后紫外滅菌30min，將葉片樣品用無(wú)菌水清洗后放入75%的酒精中浸泡60s，取出葉片樣品用無(wú)菌水清洗2次后放入0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡15s，再次用無(wú)菌水沖洗葉片樣品．將葉片樣品置于超凈工作臺(tái)后吹干，用無(wú)菌剪切成1cm的小段．將5種葉片樣品切口向下分別置于牛肉膏蛋白胨篩選培養(yǎng)基平板上，以最后一次無(wú)菌水沖洗液和完整滅菌葉片為對(duì)照，置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h．將長(zhǎng)出的紅色菌落劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，分離得到單菌落．

1.2.4 菌種液體發(fā)酵培養(yǎng)

將分離出的單菌落接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37℃、200r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48h，對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初步優(yōu)化．

碳源優(yōu)化：分別選擇蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和乳糖作為唯一碳源，設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度10、20、30、40、50g/L．以不添加碳源為對(duì)照組，對(duì)篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)(37℃、200r/min培養(yǎng)48h)，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各發(fā)酵液中綠原酸含量．

氮源的優(yōu)化：分別選擇蛋白胨、牛肉膏和玉米漿作為唯一有機(jī)氮源，硫酸銨、氯化銨和檸檬酸銨作為唯一無(wú)機(jī)氮源；設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度3、4、5、6、7g/L，以不添加氮源作為對(duì)照組，對(duì)篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)(37℃、200r/min培養(yǎng)48h)，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各發(fā)酵液中綠原酸含量．

1.2.5 綠原酸的定性和定量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)綠原酸的含量進(jìn)行定量測(cè)定(出峰面積)．以不同質(zhì)量濃度綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)．標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝26.795x＋36.897，R2＝0.9995．

發(fā)酵液中綠原酸的初步分離：3mL發(fā)酵液于10mL離心管中超聲破碎30min，12000r/min離心20min，取上清液并加入等體積的70%乙醇溶液，充分混勻后真空濃縮，再加入等體積的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層真空濃縮后，再加入等體積的50%甲醇溶液進(jìn)行溶解，待用．

HPLC檢測(cè)條件：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相A為0.5%乙酸，流動(dòng)相B為80%乙腈水溶液，流量1.0mL/min，柱溫35℃，326nm紫外檢測(cè)，進(jìn)樣量為10μL．

1.2.6 菌株的形態(tài)鑒定

使用掃描電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài).

1.2.7 菌株的分子鑒定

臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑，可以用來(lái)抑制或殺死多種病原菌，因此也可用于果蔬采后病害的防治。Sharpe等[24]研究了臭氧對(duì)灰霉菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)用6×10-7 mol/L的臭氧對(duì)灰霉菌處理48 h，氣生菌絲長(zhǎng)度由4.6 mm下降到1 mm，孢子的形成能力受到抑制，死亡率達(dá)到90%以上，顯示出直接的殺菌能力。嚴(yán)德卿等[25]研究了臭氧對(duì)楊梅果實(shí)采后病害的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)臭氧處理后好果率達(dá)到96.3%以上，明顯高于未經(jīng)處理的好果率(76.6%)。

利用菌落PCR技術(shù)擴(kuò)增內(nèi)生菌的16S rDNA基因．PCR體系：菌液0.4μL，ddH2O 8μL，Taq酶10μL，上游引物(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)0.8μL，下游引物(5′-TACGGTTACCTTGTTACG ACTT-3′)0.8μL．反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，52℃退火40s，72℃延伸5min，循環(huán)30次．

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(濃度為1.0%)驗(yàn)證．0.2g瓊脂糖加入20mL電泳緩沖液(TAE溶液)中混勻后放入微波爐加熱融化，加入1μL溴化乙錠(5000×)染料充分混勻，將上述混合液倒入制膠板中凝固，獲得瓊脂糖凝膠．將瓊脂糖凝膠放入含有電泳液的電泳槽中，取5μL PCR產(chǎn)物和2μL上樣緩沖液混合均勻后加入凝膠孔中，接通電源開(kāi)始電泳．

16S rDNA序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送金唯智測(cè)序公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI上GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST和KEGG搜索與菌株XJ-1的16SrDNA相關(guān)序列，利用MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建．

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)綠原酸菌株的分離與發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定

按照Weber等[17]的方法，在pH 6.5～7.5的范圍內(nèi)，Al3+可以與綠原酸上的羥基進(jìn)行配位，形成相對(duì)穩(wěn)定的CGA-Al3+絡(luò)合物，在培養(yǎng)基中顯示為紅色．按照此原理，從金銀花葉、薄荷葉、蒲公英葉、杜仲葉和紅薯葉中初步分離得到可能具有合成綠原酸能力的5株內(nèi)生菌(分別記為XJ-1、XJ-2、XJ-3、XJ-4、XJ-5)．為了判斷菌株是否真正具有合成綠原酸的能力，使用HPLC的方法進(jìn)一步測(cè)定了發(fā)酵液中的綠原酸含量，結(jié)果如圖1所示．

圖1 綠原酸的HPLC圖Fig. 1 HPLC chart of chlorogenic acid

由圖1可以看出：篩選出的各菌株發(fā)酵產(chǎn)物和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的保留時(shí)間，均在3.613min左右，表明這5株菌均具有生產(chǎn)綠原酸的能力．同時(shí)，HPLC的定量檢測(cè)表明，內(nèi)生菌株XJ-1、XJ-2、XJ-3、XJ-4和XJ-5發(fā)酵液中的綠原酸含量分別為9.9、3.2、6.6、5.8、4.9μg/mL．合成綠原酸能力最強(qiáng)的為菌株XJ-1，因此后續(xù)選擇菌株XJ-1為鑒定和優(yōu)化培養(yǎng)的菌株．

2.2 菌株的形態(tài)及革蘭氏染色分析

菌株XJ-1的形態(tài)鑒定如圖2所示．菌株形狀為圓形，邊緣整齊，較黏稠，表面光滑，有隆起，顏色為白色，從菌落形態(tài)上初步判斷菌株XJ-1為細(xì)菌．革蘭氏染色表明菌株XJ-1為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌．掃描電子顯微鏡觀察菌株XJ-1為桿狀菌．

圖2 菌株XJ-1的形態(tài)鑒定Fig. 2 Morphological identification of strain XJ-1

2.3 菌株的分子鑒定

采用PCR技術(shù)對(duì)菌株XJ-1的16S rDNA基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，并利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示．

圖3 瓊脂糖凝膠電泳Fig. 3 Agarose gel electrophoresis

圖3結(jié)果表明成功擴(kuò)增出16SrDNA基因，該基因序列大小為1500bp左右，與細(xì)菌的16SrDNA基因大小基本一致[18]．對(duì)該基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行序列同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)相似度為97%，因此判斷該菌株為枯草芽孢桿菌．

利用MEGA7.0軟件構(gòu)建了包含有芽孢桿菌等13個(gè)基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)．從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，菌株XJ-1與枯草芽孢桿菌位于同一集群組，表明菌株XJ-1屬于枯草芽孢桿菌．

圖4 菌株XJ-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of strain XJ-1

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的初步優(yōu)化

2.4.1 碳源

分別選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和果糖為唯一碳源，考察不同碳源對(duì)菌株XJ-1合成綠原酸的影響．結(jié)果顯示當(dāng)碳源為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和乳糖時(shí)，發(fā)酵液中綠原酸的含量較低(小于1μg/mL)，表明該菌株不能很好地利用這4種碳源合成綠原酸．當(dāng)以果糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液中卻有綠原酸產(chǎn)生，因此以果糖為唯一碳源，研究不同濃度的果糖對(duì)綠原酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5所示．隨著果糖濃度的增加，CGA的含量先增加后減少，在果糖質(zhì)量濃度為30g/L時(shí)，CGA的含量達(dá)到最大值(7.39μg/mL)，說(shuō)明高濃度的果糖可能會(huì)抑制菌株XJ-1合成綠原酸，因此選擇30g/L果糖作為碳源濃度．

圖5 不同果糖濃度對(duì)菌株XJ-1合成綠原酸的影響Fig. 5 Effects of different fructose concentrations on chlorogenic acid synthesis by strain XJ-1

2.4.2 氮源

考察了不同種類和濃度的氮源對(duì)菌株XJ-1合成綠原酸的影響，結(jié)果如圖6所示．

圖6 不同氮源對(duì)XJ-1合成綠原酸的影響Fig. 6 Effects of different nitrogen source on chlorogenic acid synthesis by strain XJ-1

不同種類和濃度的氮源對(duì)菌株XJ-1合成綠原酸的影響有明顯差距．菌株XJ-1合成綠原酸的產(chǎn)量隨著蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硫酸銨、氯化銨和檸檬酸銨濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)．在所選擇的氮源中，利用檸檬酸銨為無(wú)機(jī)氮源時(shí)，菌株XJ-1表現(xiàn)出最高的合成綠原酸的能力；利用玉米漿為有機(jī)氮源時(shí)，菌株XJ-1合成綠原酸的能力最高．

2.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇果糖、檸檬酸銨、玉米漿進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2．

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其對(duì)綠原酸產(chǎn)量的影響Tab. 1 Orthogonal experimental design and its effect on chlorogenic acid yield

表2 方差分析Tab. 2 Variance analysis

從表1可以看出，各因素極差的大小反映了其對(duì)菌株XJ-1產(chǎn)綠原酸能力影響的主次，極差越大，影響越顯著[19]，故主次因素依次為檸檬酸銨＞果糖＞玉米漿．由表2可知：3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)量的影響都不是特別顯著；此外，由表1可見(jiàn)以第5組的條件培養(yǎng)時(shí)綠原酸產(chǎn)量最高，即綠原酸的產(chǎn)量達(dá)到了24.02μg/mL，因此確定最優(yōu)碳源為果糖30g/L，最優(yōu)無(wú)機(jī)氮源為檸檬酸銨5g/L，最優(yōu)有機(jī)氮源為玉米漿6g/L．Magdalena等[20]采用響應(yīng)面(RSM)法優(yōu)化水提法提取茶葉中的CGA，獲得的最大CGA含量?jī)H為(6.66±0.58)μg/mL．相比而言，本研究利用通過(guò)初步正交優(yōu)化內(nèi)生菌培養(yǎng)基的主要成分所獲得綠原酸最大產(chǎn)量為24.02μg/mL，是Magdalena等[20]產(chǎn)量的3.6倍，是菌株XJ-1合成綠原酸初始發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)量(9.9μg/mL)的2.43倍．表明微生物發(fā)酵法在合成綠原酸方面存在較大的優(yōu)勢(shì)．

3 結(jié) 論

本研究從中藥植物樣本中分離到具有合成綠原酸能力的5株內(nèi)生菌，5株菌產(chǎn)綠原酸的能力大小為XJ-1＞XJ-3＞XJ-4＞XJ-5＞XJ-2，菌株XJ-1合成綠原酸的產(chǎn)量為9.9μg/mL．形態(tài)特征和16S rDNA序列分析鑒定結(jié)果表明，菌株XJ-1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)．經(jīng)過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的初步優(yōu)化，確定優(yōu)化后的培養(yǎng)基主要成分為果糖30g/L、檸檬酸銨5g/L、玉米漿6g/L，在此培養(yǎng)基條件下，菌株XJ-1合成綠原酸的產(chǎn)量為24.02μg/mL，是初始發(fā)酵培養(yǎng)基的2.43倍．本研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)產(chǎn)綠原酸工程菌株以及微生物發(fā)酵生產(chǎn)綠原酸提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持.