王曉亞，馬智玲，陳敬然，張志強(qiáng)，沈建梅

(北京康仁堂藥業(yè)有限公司 中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301)

片姜黃為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chenet C.Ling的干燥根莖。味辛、苦，性溫，具破血行氣、通經(jīng)止痛之功效[1]。臨床上常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛等[2]。片姜黃主要化學(xué)成分為倍半萜類、單萜類、姜黃素類化合物[3-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓凝血、抗腫瘤等作用[6]，其藥理作用主要與其含有的倍半萜類化合物密切相關(guān)。

目前，對(duì)于片姜黃含量測(cè)定及特征圖譜方面的質(zhì)量控制研究較少，部分學(xué)者采用HPLC對(duì)片姜黃藥材及飲片特征圖譜方法進(jìn)行了建構(gòu)，多選用吉馬酮為指標(biāo)成分[7-8]，但吉馬酮極性較小，水溶性較差，在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中幾乎不溶出，將其作為片姜黃配方顆粒質(zhì)量指標(biāo)有待商榷。莪術(shù)烯醇具有止痛[9]及抑制肝癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的藥理作用[10]，因此，本研究選用含量較高的藥效成分莪術(shù)烯醇作為片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分，結(jié)合特征圖譜進(jìn)行整體質(zhì)量控制，判斷更加準(zhǔn)確、客觀，符合臨床用藥需求，且為相關(guān)藥物研發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC?H-Class超高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司)，Empower色譜工作站，ME104E電子天平(梅特勒·托利多)，BSA124S電子天平(賽多利斯)，JY2002電子天平(梅特勒·托利多)，KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子恒溫水浴鍋DZKW-4(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 試藥及試劑

片姜黃對(duì)照藥材(批號(hào)：121006-201404)，中國食品藥品檢定研究院；莪術(shù)烯醇對(duì)照品(批號(hào)：E-003-181612)，成都瑞芬思生物科技有限公司；18批片姜黃飲片由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京康仁堂藥業(yè)有限公司質(zhì)量檢測(cè)中心鑒定為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chenet C.Ling的干燥根莖，經(jīng)檢驗(yàn)均符合藥典規(guī)定，樣品來源見表1。本試驗(yàn)根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》制備18批片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑。乙腈、磷酸(Fisher Chemical)為色譜純，甲醇、乙醇為分析純，水為屈臣氏純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

取片姜黃飲片，一煎加入飲片量8倍水，浸泡30 min，武火(500 W)煮沸后，文火保持微沸30 min，趁熱過濾，迅速冷卻，備用；二煎加飲片量6倍水，武火煮沸后，文火保持微沸20 min，趁熱過濾，迅速冷卻備用；合并濾液，50 ℃減壓濃縮至料液比約為1∶1(相對(duì)密度為1.05～1.10(50 ℃))，冷凍干燥，即得。

表1 片姜黃飲片的來源信息

2.2 莪術(shù)烯醇含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITYUPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～8 min，5%→20%A；8～20 min，20%→33%A；20～28 min，33%→50%A；28～33 min，50%A；33～38 min，50%→80%A；38～40 min，80%→5%A)；檢測(cè)波長：260 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.40 mL·min-1；進(jìn)樣體積：1 μL。色譜見圖1。

圖1 片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與莪術(shù)烯醇對(duì)照品的對(duì)比圖譜

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取莪術(shù)烯醇對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察。取莪術(shù)烯醇對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含莪術(shù)烯醇219.010 μg的對(duì)照品溶液，作為線性1；精密吸取對(duì)照品溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為線性2；精密吸取線性2溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為線性3；重復(fù)上述操作，依次作為線性4、線性5、線性6。精密吸取上述續(xù)濾液1 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定莪術(shù)烯醇色譜峰峰面積，以莪術(shù)烯醇色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，莪術(shù)烯醇的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得莪術(shù)烯醇的回歸方程為y=4 542.002 5x+1 445.537 3，R=1.000 0，其線性范圍為6.844 μg·mL-1～219.010 μg·mL-1。

(2)重復(fù)性試驗(yàn)。取同一供試品(190617-611930-02)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得莪術(shù)烯醇的平均含量為1.521%，RSD為0.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

(3)中間精密度試驗(yàn)。不同分析人員于不同時(shí)間采用不同儀器(Waters UPLC H-Class液相色譜儀(TUV檢測(cè)器))進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。取6份供試品溶液，測(cè)定莪術(shù)烯醇的含量。結(jié)果中間精密度試驗(yàn)所測(cè)得的莪術(shù)烯醇平均含量為1.510%，RSD值為0.7%，重復(fù)性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的RSD為0.5%，符合中間精密度要求。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄莪術(shù)烯醇峰峰面積的變化情況，24 h內(nèi)莪術(shù)烯醇的峰面積RSD值為0.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(5)加樣回收率試驗(yàn)。取莪術(shù)烯醇對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含有61.81 μg的對(duì)照品溶液。取已知含量的供試品(190617-611930-02)6份，每份約0.1 g，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液25 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定莪術(shù)烯醇的含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果表明測(cè)得回收率范圍為94.97%～96.28%，平均回收率為95.6%，RSD值為0.5%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 樣品含量測(cè)定 取18批片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定莪術(shù)烯醇含量。結(jié)果見表2。

表2 出膏率及莪術(shù)烯醇轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果 (%)

2.3 特征圖譜的建立及分析

2.3.1 色譜條件 同“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉供試品溶液進(jìn)行3D全波長掃描，結(jié)果顯示在240 nm處，圖譜中色譜信息豐富，因此選用240 nm作為特征圖譜檢測(cè)波長。

2.3.2 參照物溶液制備 取片姜黃對(duì)照藥材約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，作為對(duì)照藥材參照物溶液。另取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 同“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法。

2.3.4 方法學(xué)考察 (1)重復(fù)性試驗(yàn)。取6份供試品溶液，獲得其特征圖譜，以莪術(shù)烯醇峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.0%～0.1%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積的RSD在0.0%～2.4%范圍內(nèi)，表明該特征圖譜方法重復(fù)性較好。

(2)中間精密度試驗(yàn)。采用Waters UPLC H-Class(TUV檢測(cè)器)，取供試品溶液，獲得其特征圖譜，以莪術(shù)烯醇峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示采用Waters UPLC H-Class(TUV檢測(cè)器)獲得的特征圖譜中，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，相對(duì)峰面積的RSD值在0.0%～0.9%范圍內(nèi)。不同儀器間各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.0%～1.0%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD值在0.0%～6.9%范圍內(nèi)，表明中間精密度良好。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h按上述確定的方法進(jìn)樣測(cè)定，獲得其特征圖譜，以莪術(shù)烯醇峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值在0.0%～0.1%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積的RSD值在0.0%～1.1%范圍內(nèi)，表明供試品溶液中特征成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.5 特征圖譜的建立與相關(guān)性分析 分別制備18批片姜黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》軟件[11]，采用多點(diǎn)校正將色譜峰自動(dòng)匹配，中位數(shù)法計(jì)算得出樣品特征圖譜的共有模式，共確定4個(gè)共有峰，并與對(duì)照藥材參照物色譜峰中的4個(gè)特征峰相對(duì)應(yīng)，其中，峰3與莪術(shù)烯醇對(duì)照品參照物峰保留時(shí)間一致，見圖2、圖3、圖4。以峰3(莪術(shù)烯醇)為S峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間。相對(duì)保留時(shí)間的規(guī)定值為0.28(峰1)、0.76(峰2)、1.25(峰4)。片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑4個(gè)特征峰在飲片中均能得到追蹤，表明片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與飲片化學(xué)成分基本一致，見圖5。

3 討論

參照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》，片姜黃為根莖入藥，當(dāng)加入飲片量8倍的水量時(shí)，即可符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中“煎煮開始時(shí)的用水量一般浸過藥面2～5 cm”的要求，結(jié)合吸水率考察結(jié)果，確定片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的煎煮工藝條件為：浸泡30 min，煎煮2次，一煎加入飲片量8倍水，煎煮30 min，二煎加入飲片量6倍水，煎煮20 min。

圖2 18批片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜

圖3 片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照?qǐng)D譜及共有峰標(biāo)識(shí)

圖4 片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與參照物對(duì)比圖譜

圖5 片姜黃飲片與片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰模式標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比

本試驗(yàn)對(duì)提取溶劑、提取濃度、提取方式及提取時(shí)間進(jìn)行了供試品溶液制備考察。分別以水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇作為提取溶劑，結(jié)果表明70%甲醇提取效果最佳；選擇0.1 g·25 mL-1、0.2 g·25 mL-1、0.4 g·25 mL-1、0.8 g·25 mL-1進(jìn)行提取濃度考察，結(jié)果顯示濃度為0.2 g·25 mL-1可提取完全且峰面積適中；選擇超聲20、40、60 min及回流40 min進(jìn)行提取方式及時(shí)間考察，結(jié)果表明不同提取條件下所得結(jié)果差異不大，為確保供試品均可提取完全，且考慮到操作的簡便性，故選擇超聲處理40 min。

本試驗(yàn)基于UPLC采用同一梯度洗脫程序于不同檢測(cè)波長條件下，建立了片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測(cè)定方法及特征圖譜方法，方法學(xué)考察均符合要求，表明該方法穩(wěn)定可行、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，特征圖譜結(jié)合莪術(shù)烯醇定量的評(píng)價(jià)方法可較全面地反映片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的內(nèi)在質(zhì)量，為片姜黃配方顆粒的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供參考。

將片姜黃中提取的揮發(fā)油進(jìn)樣對(duì)比發(fā)現(xiàn)，片姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜中的4號(hào)峰為揮發(fā)油成分，由于其水溶性差，且提取、濃縮等過程中會(huì)造成揮發(fā)油損失，故轉(zhuǎn)移率較低。因此，片姜黃配方顆粒需采用先提取收集揮發(fā)油，再將揮發(fā)油包合物與濃縮液混合后干燥的方式進(jìn)行制備，以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)傳遞，使得片姜黃配方顆粒的主要成分能夠與標(biāo)準(zhǔn)湯劑保持一致。