黃鈺青，梅 杰，江正瑾，黃 洋*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；2.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511486)

三七 [Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]是五加科植物三七的干燥根和根莖[1]，是我國重要的民族藥，其中主要含有三七皂苷[2-3]、黃酮類[4]、揮發(fā)油[5]等多種化學(xué)成分；具有活血止血[6]、抗腫瘤[7]、降血糖[8]、抗衰老[9]等多種藥理作用。但市面上的三七質(zhì)量參差不齊，且不同質(zhì)量三七藥材之間的價(jià)格相差甚遠(yuǎn)，故建立三七質(zhì)量評(píng)價(jià)方法很有必要?！吨腥A人民共和國藥典》[1]中收載的三七藥用部位是主根、支根和根莖，說明不同藥用部位均可入藥，但是不同部位的成分是否存在差異，截至目前研究尚少。現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中所涉及的方法如液相色譜、薄層色譜法均無法實(shí)現(xiàn)三七不同部位的準(zhǔn)確區(qū)分[1]。本研究基于LC-MS技術(shù)結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法，以期建立三七質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，試圖區(qū)分三七不同藥用部位，完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260超高效液相色譜儀、Agilent OpenLab ChemStation色譜工作站(C.01.05版本)、Agilent 6130單四極桿質(zhì)譜檢測器(美國Agilent Technology公司)；SPSS 21.0軟件(美國IBM公司)；SIMCA-P 14.1 軟件(瑞典Umetrics公司)；Origin 2018軟件(美國Microcal公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；藥典篩(浙江上虞市張興紗篩廠)；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司；DHG系列恒溫干燥箱(廣州市泉宏科學(xué)儀器有限公司)；溶劑過濾器、0.22 μm微孔過濾膜(有機(jī)系)、0.45 μm微孔過濾膜(水系)均來自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試劑與藥材

三七皂苷R1(批號(hào)CHB190124，純度≥98%)，人參皂苷Rb2(批號(hào)CHB190102，純度≥98%)，人參皂苷Rb3(批號(hào)CHB190103，純度≥98%)，人參皂苷Rd(批號(hào)CHB190127，純度≥98%)，人參皂苷Re(批號(hào)CHB190107，純度≥98%)，20-人參皂苷Rf(批號(hào)CHB190108，純度≥98%)，20(S)-人參皂苷-Rg2(批號(hào)CHB190117，純度≥98%)，以上標(biāo)準(zhǔn)品均購于成都克洛瑪生物科技有限公司，人參皂苷Rb1(批號(hào)P19S10U98130，純度≥98%)，人參皂苷Rc(批號(hào)Z10S11B123849，純度≥98%)，人參皂苷Rg1(批號(hào)G30N10Y104330，純度≥98%)，均購于上海源葉生物科技有限公司。

甲酸(FA)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)購自德國默克生物科技有限公司，均為色譜純。樣品進(jìn)樣前均用0.22 μm有機(jī)濾膜(Bonna-Agela Technologies，天津)過濾。34批樣品產(chǎn)地均為云南文山，均購于云南文山市文山三七國際交易市場，其中S1-S7及S25-S29為一批次，S8-S15及S30-S34為二批次，S16-S24為三批次，包括4批絨根、5批剪口、5批根條和20批主根。所有樣品均經(jīng)深圳市藥品檢驗(yàn)研究院中藥室鑒定為該類藥材。

2 方法

2.1 高效液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：ACN(含0.02%FA)(A)-H2O(含0.02%FA)(B)，梯度洗脫：0～20 min，20%A；20～29 min，20～29%A；29～60 min，29～40%A。流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：25 ℃。

三七皂苷存在形式：化合物加鈉形式([M+Na]+)；幕簾氣：氮?dú)?；霧化氣：幕簾氣；霧化氣壓力：35 psi；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；操作模式：選擇離子模式(SIM)；檢測模式：ESI正離子模式；干燥氣流速：12 L/min；干燥氣溫度：350 ℃。三七提取物中分析物的LC-MS裂解信息見表1。

表1 三七提取物中分析物的LC-MS裂解信息

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取三七標(biāo)準(zhǔn)品各適量，精密稱定，用甲醇溶解，配成標(biāo)準(zhǔn)品母液，作為對(duì)照品溶液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱，備用。經(jīng)純甲醇稀釋，得到如下濃度的三七混標(biāo)對(duì)照品溶液：0.04 mg/mL的20(S)-人參皂苷-Rg2和人參皂苷Rg1；0.08 mg/mL的人參皂苷Re 及20-人參皂-Rf；0.09 mg/mL的三七皂苷R1；0.12 mg/mL的人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc及人參皂苷Rd。用 0.22 μm 微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液即得。

2.3 供試品溶液的制備

取過4號(hào)篩的三七樣品粉末0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液25 mL稱定重量，超聲處理2次，每次30 min，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取三七樣本S3，按“2.3”條件處理供試品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，與空白溶劑同法制備所得圖譜進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見圖1。峰1-峰10經(jīng)單標(biāo)進(jìn)樣對(duì)比及質(zhì)譜分子量確認(rèn)，指認(rèn)其分別為：三七皂苷 R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、20-人參皂苷-Rf、20(S)-人參皂苷-Rg2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd。其中Rg1和R1的分離度大于1.5，Rg1的理論塔板數(shù)大于6 000，表明該方法符合《中華人民共和國藥典》[1]中指紋圖譜的基本要求。

圖1 空白溶劑及混標(biāo)溶液的HPLC色譜

2.4.2 重復(fù)性 取三七樣本S3，平行制備5份供試品溶液(S3-1-S3-5)，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明，各峰的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.08%～1.00%，峰面積的RSD為3.37%～7.80%，表明方法重現(xiàn)性良好，符合指紋圖譜相關(guān)要求。

2.4.3 精密度 取“2.4.2”中S3-1供試品溶液，在“2.1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明，各峰保留時(shí)間的RSD為0.10%～0.52%，峰面積的RSD為4.01%～7.26%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜相關(guān)要求。

3 結(jié)果與分析

3.1 指紋圖譜的構(gòu)建

將34批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin 2018軟件繪制出樣品峰的疊加圖譜，如圖2 所示。發(fā)現(xiàn)有6個(gè)相似度較高的共有峰，分別標(biāo)為峰1-峰6。經(jīng)指認(rèn)，峰1-峰6所指示的化學(xué)成分分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、20(S)-人參皂苷-Rg2、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd。由于這6個(gè)共有峰均存在不同部位的三七樣品中，難以加以區(qū)分，故將引入化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)進(jìn)行研究。

3.2 三七不同部位的化學(xué)模式識(shí)別研究

3.2.1 數(shù)據(jù)分析 通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012A版)軟件對(duì)LC-MS指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到其相似度結(jié)果見表2，由于不同藥用部位的色譜峰峰面積數(shù)據(jù)之間的個(gè)體差異較大，嚴(yán)重影響統(tǒng)計(jì)分析，故采用SPSS 21.0軟件中Z-score法，將34批三七不同部位樣品峰面積信息，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)化處理。Z-score標(biāo)準(zhǔn)化方法是目前最常用的多變量綜合分析方法之一，計(jì)算公式為標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù) =(原始數(shù)據(jù)-均值)/ 標(biāo)準(zhǔn)差。采用 SIMCA-14.1軟件來進(jìn)行聚類分析(HCA)，主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)分析，用于分類模型的建立；當(dāng)應(yīng)用PLS-DA法用于分析研究時(shí)，通常需要將樣品劃分為訓(xùn)練集、測試集，前者用于模型的建立，后者用于模型的驗(yàn)證。

3.2.2 HCA 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，將其導(dǎo)入Simca-P 14.1 軟件，進(jìn)行聚類分析。聚類分析結(jié)果如圖3-A所示，34批樣品的化學(xué)信息按照相似性劃分為剪口(綠色)、絨根(藍(lán)色)和主根(紅色)三個(gè)大類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化學(xué)信息與其他部位差別較大的剪口可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確區(qū)分，但化學(xué)信息相似性較高的其他類別則會(huì)出現(xiàn)分類錯(cuò)誤，如錯(cuò)誤地將S3(主根)樣品劃分在絨根組別中，且分類類別不能識(shí)別根條組別，與按不同分類部位分出來的四組類別有所出入。結(jié)果表明，無監(jiān)督的HCA方法并不能準(zhǔn)確地將相似度較高的化學(xué)信息的區(qū)別并進(jìn)行區(qū)分。

圖2 34批三七藥材的指紋圖譜疊加分析

表2 三七樣品來源信息及指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

3.2.3 PCA PCA分析是應(yīng)用最為廣泛的無監(jiān)督模式識(shí)別方法，為直觀預(yù)覽樣品的整體分布情況，本研究對(duì)34批樣品進(jìn)行PCA分析，如圖3-B，得到R2值與Q2值，R2是指變量解釋模型分類的能力，數(shù)值越大，代表該模型的擬合能力越強(qiáng)；Q2是指變量預(yù)測分類模型的能力，其值越大，代表模型的預(yù)測能力越好。一般以R2、Q2>0.5為指標(biāo)，認(rèn)為模型擬合和預(yù)測能力良好，其值越接近1，代表模型越好。結(jié)果表明，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為93.9%，其中第一、第二和第三主成分的貢獻(xiàn)率分別為46.0%、29.7%和18.3%，可以表征所提取的大部分化學(xué)成分信息。且模型的Q2=0.723，代表該模型具備72.3%的預(yù)測準(zhǔn)確率，即該模型預(yù)測能力較強(qiáng)。由圖3-B可見，樣品初步按不同部位分為四類且因散點(diǎn)圖分布較近，質(zhì)量很接近。綠色、藍(lán)色、黃色和紅色的聚類中心分別為三七剪口、根條、絨根和主根。其中剪口和絨根可以分別被區(qū)分開來，但是主根與根條兩個(gè)部位之間則無法區(qū)分。且由圖中紅色點(diǎn)所代表的主根S3所在位置所示，它在分類時(shí)被分入藍(lán)色的根條類別，顯示無監(jiān)督的PCA法在分類時(shí)會(huì)造成誤判，需要通過有監(jiān)督的PLS-DA法進(jìn)行進(jìn)一步分析。

3.2.4 PLS-DA 本研究隨機(jī)將其中的20批樣品(S1-S15、S25-S29)劃分為訓(xùn)練集，另外10批樣品作為驗(yàn)證集。首先對(duì)訓(xùn)練集進(jìn)行分析，建立PLS-DA模型，結(jié)果如圖4-A所示。前三個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.2%(R2X=0.942)，第一、第二和第三主成分的貢獻(xiàn)率分別為48.7%、29.4%、16.1%，表明可以表征所提取的大部分化學(xué)成分信息。樣品較好地形成了四個(gè)聚類中心，四類成分基本上實(shí)現(xiàn)了區(qū)分。訓(xùn)練集PLS-DA模型中，模型擬合能力參數(shù)為94.2%(R2X)，模型區(qū)分參數(shù)為72.7%(R2Y)，模型預(yù)測度為54.7%(Q2)，表明模型具有良好的穩(wěn)定性和預(yù)測準(zhǔn)確性。為驗(yàn)證模型是否過度擬合，對(duì)其進(jìn)行了200次置換檢驗(yàn)，結(jié)果如圖4-B所示，其中R2=0.056 8<0.4，Q2=-0.465<0.05，表明模型沒有過度擬合[10]。外部檢驗(yàn)。此外，我們還使用14批驗(yàn)證集樣品(S16-S24、S30-34)對(duì)所建模型進(jìn)行外部檢驗(yàn)。結(jié)果如圖4-C所示。模型的R2X=0.974、R2Y=0.767和Q2=0.478，驗(yàn)證結(jié)果與訓(xùn)練集較吻合，模型判別正確率為100%，進(jìn)一步證實(shí)了模型的準(zhǔn)確可靠。

圖3 34批三七樣品的聚類分析圖(A)及主成分分析圖(B)

圖4 訓(xùn)練集的PLS-DA得分圖(A)、內(nèi)部檢驗(yàn)結(jié)果(B)及外部檢驗(yàn)結(jié)果(C)

特征提取。為進(jìn)一步篩選出對(duì)樣品分類貢獻(xiàn)較大的成分，即質(zhì)量標(biāo)記物，選用PLS-DA中最常用的Variable Importance for the Project(VIP)值來評(píng)價(jià)變量的貢獻(xiàn)大小。其中VIP值越大，代表該變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)度越大。一般以VIP值>1.0作為指標(biāo)，對(duì)變量進(jìn)行篩選，并對(duì)其進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，得到具有顯著差異(P<0.01)的特征峰，即為特征性成分，如圖5-A所示。VIP值>1.0的峰分別為峰 5、峰 6、峰 7和峰 4，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，指認(rèn)其所代表的化合物分別為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和20(S)-人參皂苷-Rg2。

模型再建立及驗(yàn)證。為了驗(yàn)證所篩選的特征性成分是否合理，采用特征峰對(duì)訓(xùn)練集樣品再次建模，結(jié)果如圖5-B所示。四類樣品得到有效地區(qū)分，模型累計(jì)貢獻(xiàn)率(R2X)為97.5%，可以表征絕大部分的化學(xué)信息。且模型區(qū)分參數(shù)為73.8%(R2Y)，模型預(yù)測準(zhǔn)確度為56.8%(Q2)。且經(jīng)特征提取后再建立的PLS-DA模型的S3樣本，更接近紅色的主根區(qū)域了，說明該模型具有更優(yōu)的擬合能力和分類判別能力。通過對(duì)模型進(jìn)行內(nèi)部檢驗(yàn)(圖5-C)，以及外部驗(yàn)證(圖5-D)，說明模型具有良好的擬合能力和預(yù)測準(zhǔn)確度。

其中內(nèi)部檢驗(yàn)的200次置換檢驗(yàn)結(jié)果如圖5-C所示，R2=-0.003 91<0.4，Q2=-0.338<0.05，表明模型沒有過度擬合。外部驗(yàn)證結(jié)果如圖5-D，且模型的累計(jì)貢獻(xiàn)率(R2X)為100.0%，可以表征所有化學(xué)信息，模型區(qū)分參數(shù)為73.6%(R2Y)，模型預(yù)測準(zhǔn)確度為52.2%(Q2)，四類樣品能夠?qū)崿F(xiàn)有效區(qū)分，且模型判別準(zhǔn)確率為100%，表明該模型擬合能力較強(qiáng)。

4 討論

4.1 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃)、不同的流動(dòng)相體系(0.1%FA/ACN、H2O/ACN和H2O/MeOH)和不同濃度的FA添加劑(0.1%、0.05%和0.02%的FA-H2O/ACN)對(duì)峰形、基線、峰響應(yīng)、分離度等的影響，最終選擇25 ℃柱溫，使用H2O/ACN流動(dòng)相，并添加0.02%FA添加劑作為色譜條件。

4.2 與2020版《中華人民共和國藥典》的三七指紋圖譜比較

對(duì)比2020版《中華人民共和國藥典》中現(xiàn)有的指標(biāo)性成分：人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷R1，本實(shí)驗(yàn)所篩選出的特征性成分與藥典規(guī)定的指標(biāo)有重合(人參皂苷Rb1)，但也在藥典的基礎(chǔ)上更多了三個(gè)指標(biāo)性成分：人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rg2，說明化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)的引入可以實(shí)現(xiàn)三七不同部位的質(zhì)量區(qū)分，這也說明這些不同藥用部位的質(zhì)量是存在一定的區(qū)別，但其藥效上的差異還有待進(jìn)一步研究。

4.3 PLS-DA法和PCA法的R2X、R2Y 和Q2的參數(shù)對(duì)比

將幾種模型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果如表4所示，PLS-DA模型能夠?qū)崿F(xiàn)四類不同藥用部位的準(zhǔn)確區(qū)分；和特征提取后的PLS-DA相比，R2X、R2Y和Q2均明顯提高，表明模型區(qū)分能力也有所提升，預(yù)測能力符合規(guī)定，說明該4個(gè)特征成分能夠?yàn)槿卟煌幱貌课坏膮^(qū)分提供更加有效的數(shù)據(jù)支持。

5 結(jié)論

本研究表明通過將化學(xué)模式識(shí)別方法與LC-MS指紋圖譜相結(jié)合，建立了區(qū)分三七不同部位的PLS-DA模型，所得到的四個(gè)特征性成分人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和20(S)-人參皂苷-Rg2，該特征性成分能夠較好地實(shí)現(xiàn)中藥三七四種不同藥用部位的區(qū)分。這可對(duì)三七質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供可靠數(shù)據(jù)與有效補(bǔ)充。