樊峰秀，李陳亞，Charles Amanze，郝碧芳

(江蘇科技大學 生物技術學院，鎮(zhèn)江 212100)

內(nèi)質網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白質折疊和成熟的場所，分子伴侶在此過程中發(fā)揮重要作用[1].在細胞合成新生蛋白過程中，分子伴侶通過引導蛋白質在內(nèi)質網(wǎng)正確的折疊及新生蛋白質在胞內(nèi)的轉運來發(fā)揮作用.分子伴侶在病毒感染、加熱、重金屬或缺氧等應激情況下，其表達會發(fā)生變化，以增強細胞在應激情況下的生存能力[2-8].結合免疫球蛋白(Binding immunoglobulin protein, BiP)，又稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein 78, GRP78)，是熱休克蛋白70(Heat shock 70 kDa protein, Hsp70)家族成員之一，具有內(nèi)質網(wǎng)分子伴侶的功能.

桿狀病毒是一類主要感染節(jié)肢動物的病原微生物[9]，桿狀病毒在感染循環(huán)過程中產(chǎn)生兩種不同表型的病毒粒子：芽生病毒粒子(budded virus, BV)和包涵體來源的病毒粒子(occlusion derived virus, ODV).ODV介導病毒入侵蟲體的口服感染過程[10-11]，BV介導病毒在蟲體組織間的傳播[12-14].家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)是研究較多的兩種桿狀病毒，基因組同源性達到90 %[15]，但是兩種病毒的宿主域差異顯著，AcMNPV可以感染多種昆蟲，而BmNPV主要感染家蠶，具體機理仍不是特別清楚.已有研究發(fā)現(xiàn)兩種病毒的入侵方式有顯著差別，AcMNPV主要采用Clathrin介導的內(nèi)吞途徑入侵宿主細胞，而且人工誘導的直接膜融合方式也可以使其有效感染細胞[16]；與AcMNPV不同，BmNPV BV以巨胞飲的內(nèi)吞方式入侵宿主細胞，人工誘導的直接膜融合方式則導致病毒喪失感染性[17].為了進一步探索BmNPV的感染機制，應用高通量測序技術對BmNPV BV以巨胞飲的內(nèi)吞方式及人工誘導的直接膜融合方式感染的BmN細胞進行差異表達基因篩選，發(fā)現(xiàn)家蠶BiP(BmBiP)是表達顯著差異基因之一[18].到目前為止，有關BmBiP在BmNPV感染家蠶過程中的作用還鮮有報道，因此，文中克隆了BmBiP基因，并分析了家蠶和其他6種昆蟲BiP基因的相似性及親緣關系，檢測了病毒感染后其表達量的變化，最后利用RNA干涉技術探索了敲低BmBiP對病毒感染的影響，研究結果為深入闡釋BmBiP參與病毒感染過程提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒

細胞系：BmN細胞(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點實驗室保存)用標準方法在含10%胎牛血清(Gibco)的TC-100培養(yǎng)基(Applichem)昆蟲培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27 ℃.

病毒：BmBacJS13-egfp(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點實驗室保存)是一株與BmNPV 具有相同感染特性重組病毒[19]，將增強型綠色熒光蛋白基因(egfp)通過轉座的方式重組到BmNPV基因組上，病毒感染細胞后即可在感染的細胞中表達綠色熒光蛋白，方便觀察和統(tǒng)計感染細胞的數(shù)量.

1.2 總RNA的提取及cDNA制備

將處于對數(shù)生長期的25 cm2的 BmN細胞用PBS洗兩遍后，3 000 r·min-1離心10 min收集細胞沉淀，根據(jù)TRIzol? Reagent(Invitogen)說明書，加入500 μL TRIzol裂解細胞，提取BmN細胞總RNA.電泳檢測總RNA的完整性，而后按照PrimescriptTMRT reagent Master Mix(TaKaRa公司)反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 BmBiP基因的克隆與測序

根據(jù)Genebank上登陸的BmBiP序列(Genebank accession No.ACL36370.1)設計一對引物：BiP-F: 5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGGTCAAGATGCGGTGG-3’和BiP-R: 5’-CCGCTCGAGTTACAACTCGTCCTTGAAGTCG-3’，兩條引物包含NotI和XhoI酶切位點.以上述獲得的cDNA為模板，利用rTaq(TaKaRa)PCR擴增BmBiP基因，電泳檢測擴增的目的片段并進行回收，連接到pMD18-T載體(TaKaRa)，由生物公司進行測序(尚亞生物技術有限公司)，鑒定正確后用于后續(xù)序列比對分析.

1.4 生物信息學分析

利用Bioedit軟件對家蠶和NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索的小菜蛾(Plutellaxylostella)、黑脈金斑蝶(Danausplexippus)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)、范式搖蚊(Polypedilumvanderplanki)和嗜卷書虱(Liposcelisbostrychophila)進行多序列比對，并用軟件MEGA6.0的生物進化距離法構建系統(tǒng)進化樹，校正參數(shù)Bootstrap設置為100次重復.

1.5 蛋白質印跡檢測病毒感染后BiP表達變化

將處于對數(shù)生長期的5×105個BmN細胞接種到直徑35 mm的細胞培養(yǎng)皿中，以10個感染復數(shù)的BmBacJS13-egfp感染BmN細胞，孵育1 h后，去除含病毒的培養(yǎng)基，用無血清TC-100培養(yǎng)基輕輕清洗細胞兩次，添加含10 % 胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基標準培養(yǎng).分別在感染后24、48和72 h收集細胞，PBS洗兩遍后，離心收取細胞樣品，用50 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液裂解細胞，95℃煮沸5 min，樣品12 000 r·min-1離心5 min備用.

取10 μL上清樣品經(jīng)12 % SDS-PAGE膠分離后，將蛋白轉移至PVDF膜上.將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中4 ℃封閉過夜；加入稀釋1 000倍的GRP78多克隆抗體(Thermo Fisher Scientific)孵育2 h，用TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min；二抗為堿性磷酸酶標記的羊抗兔的IgG(Promega)，用0.5 % 脫脂牛奶稀釋5 000倍，將膜浸入二抗中，孵育1 h，TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min，用NBT與BCIP(上海生工生物工程股份有限公司)顯色，檢測目的蛋白表達變化.

1.6 BmN細胞中BmBiP RNA干擾及病毒感染分析

為了進一步分析BiP在病毒感染中的作用，利用RNA干擾技術敲低BmN細胞中的BiP表達水平，而后用病毒感染BmN細胞，并通過流式細胞儀分析感染效果.將1×105個處于對數(shù)生長期的細胞接種到24孔的細胞培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng)，分別取2 ng的siRNA-BiP(序列為：5’-CCACUUACUCAUGUGUCGGUGUCUA-3’及5’-UAGACACCGACACAUGAGUAAGUG G-3’)和siRNA-NC(序列為5’-CCAUCAUGUACCUGUGUGGUUCCUA-3’及 5’-UAGGAA CCACACAGGUACAUGAUGG-3’)稀釋液與1 μL的EnteransterTM-R4000(英格恩生物公司)的轉染液混合，室溫靜置15 min，將轉染復合物添加到細胞培養(yǎng)皿中，6 h后更換新的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，以10個感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)的BmBacJS13-egfp感染BmN細胞，孵育2 h后，去除含病毒的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基輕輕清洗細胞兩次，添加新鮮培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h，而后用PBS洗細胞兩次，利用流式細胞儀(FACSCalibur, BD)測定表達綠色熒光蛋白的細胞比率.

2 結果與分析

2.1 BmBiP基因序列分析

利用TRIzol提取BmN細胞的總RNA，通過完整性分析，確定較好的RNA樣品用于cDNA合成，通過兩步法PCR擴增BmBiP基因，瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)一條大小約2 000 bp的特異性擴增條帶(圖1)，而對照則無擴增產(chǎn)物，表明該條帶是BmBiP的擴增產(chǎn)物.將擴增產(chǎn)物連接在pMD18-T載體后進行測序分析，結果表明BmBiP基因全長為1977 nt，與Genebank(ACL36270.1)中的家蠶BiP基因同源性很高，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)僅有4個氨基酸的差異(16A/P, 275R/K, 320F/S, 479H/Y).

M: DL2000 Marker；1-2: PCR 擴增產(chǎn)物; C: 陰性對照

根據(jù)BmBiP的cDNA序列演繹的氨基酸序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫搜索選取了6種昆蟲BiP的氨基酸序列，進行同源比對分析.結果顯示，家蠶的BiP與小菜蛾、黑脈金斑蝶、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾、范式搖蚊的BiP同源性比較高，其同源性分別為94.97 %、94.97 %、94.69 %、93.78 %、93.78 %，而與嗜卷書虱的BiP同源性較低，達到88.7%(圖2)，主要的差異存在于其N端和C端序列，而且在所有的物種BiP的C端都檢測到典型內(nèi)質網(wǎng)定位信號KDEL序列，同源比對分析結果表明BiP在物種進化過程中保守性較強.

圖2 家蠶和其他6種昆蟲的BiP氨基酸序列比對分析

利用生物進化距離法構建了家蠶與其他6種昆蟲的BiP系統(tǒng)進化樹(圖3)，校正參數(shù)Bootstrap設置為100次重復.結果表明家蠶與小菜蛾親緣關系最近，而粉紋夜蛾和草地貪夜蛾關系較近，黑脈金斑蝶與草地貪夜蛾、粉紋夜蛾聚在同一個大的分支上，范式搖蚊與以上物種關系較遠，而嗜卷書虱與其他昆蟲物種親緣關系最遠(圖3).

圖3 基于MEGA6.0軟件的家蠶和其他6種昆蟲BiP氨基酸序列的進化樹

2.2 BmNPV感染上調(diào)BmN細胞中BiP的表達

以10個MOI的BmBacJS13-egfp感染BmN細胞，分別在感染后24、48和72 h收獲細胞，通過SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白轉移到PVDF膜上，利用BiP特異抗體蛋白質檢查BmBiP不同時間的表達變化，以未感染的細胞樣品為對照.結果表明，在感染細胞和健康細胞中都檢測到一條特異性條帶，其中病毒感染后不同時間細胞中BiP的表達水平明顯高于健康細胞(圖4，箭頭所示)，而在感染后不同時間則無明顯差異，這表明病毒感染顯著上調(diào)BmN細胞內(nèi)BiP的表達水平.

M：蛋白質標記；1-3：病毒感染后24，36，72 h細胞樣品；C：健康細胞，箭頭所示BiP蛋白

2.3 敲低BmBiP表達降低了病毒感染效率

已有研究表明小RNA參與BmNPV感染[20]，為了進一步確定BiP對BmNPV感染的影響，分別用siRNA-BiP和siRNA-NC轉染BmN細胞，轉染后24 h，用攜帶綠色熒光蛋白報告基因的重組病毒BmBacJS13-egfp感染細胞，感染后48 h，收集細胞，用PBS洗滌BmN細胞兩次，并用1 mL PBS懸浮細胞，用流式細胞儀統(tǒng)計表達綠色熒光蛋白細胞的比例.結果如圖5，siRNA敲低細胞內(nèi)的BmBiP表達后，其被BmNPV病毒感染的比率僅為對照(BiP-NC)的68.37%(P<0.001)，這表明BiP參與BmNPV的入侵過程，BiP表達的下調(diào)極顯著影響病毒的入侵效率.

圖5 siRNA-BiP干擾BmN細胞后病毒感染率變化

3 結論

最新的研究表明BmNPV以巨胞飲的內(nèi)吞方式入侵宿主細胞，人為誘導的病毒在早期內(nèi)吞體內(nèi)的膜融合方式可以使BmNPV進入宿主細胞質[17]，但是病毒不能有效地進入細胞核導致感染失敗，而正常的內(nèi)吞途徑可以使BmNPV病毒粒子進入細胞核起始感染，機理不清楚.研究發(fā)現(xiàn)AcMNPV病毒粒子從核孔進入細胞核內(nèi)，而細胞核周圍是被內(nèi)質網(wǎng)緊密包被的，所以內(nèi)質網(wǎng)與病毒入核可能有關[21].腺病毒是一種無囊膜的DNA病毒，2型腺病毒感染BHK-21和HeLa 細胞后，其核衣殼穿刺細胞膜后，分子伴侶蛋白HSP70 和 HSC70(heat shock cognate protein 70)會和核衣殼結合，通過免疫熒光共定位與細胞組分分離證實HSP70蛋白進入細胞核，并且與病毒粒子共定位于細胞核；進一步分離HSP70蛋白發(fā)現(xiàn)，它以一種復合體存在，并且和病毒顆粒交聯(lián)在一起；免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)HSP70及 HSC70和病毒衣殼蛋白Hexon有相互作用[22]，這些研究表明宿主BiP參與腺病毒入侵宿主過程.

在探索BmNPV的感染機制過程中，研究團隊分別用BmNPV的BV以巨胞飲的內(nèi)吞方式和人工誘導的直接膜融合方式感染BmN細胞，高通量測序篩選BmN差異表達基因，發(fā)現(xiàn)BmBiP是表達顯著差異基因之一.本研究克隆了BmBip基因，序列比對和進化分析表明BiP基因是一個保守性較強的基因，免疫印跡檢測證明在BmNPV感染BmN細胞后BmBiP的表達量增加；而敲低BmBiP表達后，BmNPV的感染率顯著降低，表明BmBiP參與BmNPV感染細胞的過程，BmBiP與腺病毒BiP有類似的功能.

而文獻[23]研究發(fā)現(xiàn)人巨細胞病毒能精確的控制感染的人包皮成纖維細胞中BiP/GRP78的表達，以有利于病毒的復制；分別在病毒感后不同時間去除細胞內(nèi)的BiP/GRP78，發(fā)現(xiàn)對病毒蛋白的合成影響很小，但是明顯抑制了子代病毒的合成，暗示BiP/GRP78參與子代病毒的形成；電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，當去除細胞的BiP/GRP78后，導致感染病毒核衣殼無法釋放或者導致大量核衣殼聚集在核膜外，表明BiP主要參與病毒粒子組裝形成.

病毒入侵及釋放是一個較為復雜的病毒與宿主相互作用的一個過程，已有研究表明BiP在不同病毒的感染過程中作用有所差異.本研究首次分析BiP在BmNPV的感染過程的作用，通過敲低BiP的表達，確定病毒對細胞感染率顯著下降，這表明BiP參與BmNPV的入侵過程，但BiP是否參與病毒粒子在細胞內(nèi)的運輸，以及是否介導病毒粒子入核需要深入研究.