張愛(ài)瓊 ，黎娜銘 ，黃 書(shū) ，張宇鑫 ，吳 艷 ，吳學(xué)祥

（1.畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省獨(dú)山縣麻尾鎮(zhèn)人民政府，貴州 獨(dú)山 558206）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一種無(wú)芽胞、無(wú)鞭毛的革蘭氏陽(yáng)性菌，顯微鏡下似葡萄串狀，直徑0.5~1.5 μm，適宜在普通培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在麥康凱平板培養(yǎng)基上幾乎不能繁殖。該菌廣泛存在于大氣環(huán)境、飼料、食物、水源、場(chǎng)地以及物體表面，對(duì)人和畜禽具有一定的致病性，可引發(fā)受傷感染、化膿病癥、腸內(nèi)炎癥、敗血癥及毒素作用，可存在于畜禽的表皮、黏膜、大腸、鼻腔及氣管，甚至是乳腺中。近年來(lái)，金黃色葡萄球菌耐甲氧西林分離株的逐漸增加，耐藥性發(fā)生變異，臨床用藥變得復(fù)雜化，給臨床豬只疫病防治帶來(lái)了很大的困難，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離鑒定以及耐藥性分析具有非常重要的意義，本試驗(yàn)旨在為金黃色葡萄球菌病原的實(shí)驗(yàn)室診斷和相關(guān)疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料組織

無(wú)菌采集的貴陽(yáng)市花溪區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)附近某養(yǎng)殖戶(hù)病豬的喉、氣管、肺臟等組織樣品。

1.2 主要試劑

革蘭氏染色液試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（Solarbio）；Taq PCR MasterMix for PAGE，購(gòu)自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；抗菌藥物藥敏紙片，購(gòu)自杭州馳成醫(yī)藥科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購(gòu)自南京全隆生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 PCR擴(kuò)增引物

細(xì)菌16S通用引物（預(yù)擴(kuò)增 片 段 1 481bp） F：5’-AGA GTTTGATCATGGCTCA G-3’，R ：5’-TACGGTTACCTT GTTACGACTT-3’。

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，用接種環(huán)取少量的豬喉、氣管、肺等組織接種于普通瓊脂平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h，無(wú)菌挑取單個(gè)完整的菌落，接種于普通肉湯培養(yǎng)基，進(jìn)行純化培養(yǎng)得到純培養(yǎng)物。

1.5 光學(xué)顯微鏡鑒定

將單個(gè)菌落培養(yǎng)得到的菌液進(jìn)行涂片、固定、結(jié)晶紫初染、碘液媒染、酒精脫色、番紅復(fù)染后自然干燥晾干，隨后將革蘭氏染色得到的涂片置顯微鏡下觀察，并拍照記錄結(jié)果。

1.6 生化鑒定

在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取分離純化的細(xì)菌接種于生化反應(yīng)管中。為了保證反應(yīng)的效果與準(zhǔn)確性，接種環(huán)要深入生化管底部反復(fù)抽動(dòng)幾次以使菌液能混勻整個(gè)生化管。用封口膠將反應(yīng)管?chē)?yán)密封口，置于37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)23 h，觀察并記錄各管的試驗(yàn)結(jié)果。

1.7 PCR檢測(cè)鑒定

將培養(yǎng)的細(xì)菌樣品利用水煮法提取核酸，用細(xì)菌16S（F/R）通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系（15.0 μL）：Taq PCR MasterMix 酶7.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，核 酸 模 板 1.0 μL，ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃1 min，57℃ 40 s，72℃ 2 min，38 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取出產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀中觀察，并拍照記錄。

1.8 PCR產(chǎn)物的測(cè)序與遺傳進(jìn)化分析

將PCR擴(kuò)增得到的目的條帶DNA純化后，送至生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)拼接后，運(yùn)用DNAStar程序和MEGA5軟件進(jìn)行相似性和遺傳進(jìn)化分析。

1.9 藥敏試驗(yàn)

吸取1 mL菌液于均勻涂布在培養(yǎng)皿的普通培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基中的菌液風(fēng)干后，用鑷子夾取藥敏紙片置于培養(yǎng)基中，輕輕按壓紙片，以同樣操作在培養(yǎng)皿四周等距離貼上藥敏紙片。藥敏紙片的排布方式為正中央1個(gè)，邊緣等距離貼5個(gè)，每個(gè)培養(yǎng)皿設(shè)布6個(gè)藥敏紙片，共用5個(gè)培養(yǎng)皿測(cè)試細(xì)菌對(duì)30種藥物的敏感性。將藥片貼好后做標(biāo)記，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23 h，觀察并測(cè)量各抑菌圈的直徑，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬源金黃色葡萄球菌培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到單個(gè)的菌落，呈圓形，中等大小，直徑約為0.8~1.0 μm。顏色為不透明，呈乳白色到金黃色之間。菌落邊緣整齊，表面光滑、濕潤(rùn)、稍隆起。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)在LB液體培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)均勻渾濁現(xiàn)象。

2.2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

挑取單個(gè)菌落經(jīng)革蘭氏染色觀察，結(jié)果顯示該菌紫色球菌，大部分呈葡萄串狀排列，少許為單個(gè)、成雙或鏈狀排列，如圖1所示。

圖1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

挑取培養(yǎng)菌接種于10種生化反應(yīng)管，在恒溫箱（37℃）中培養(yǎng)24 h后，結(jié)果如表1所示，分離菌株可以分解乳糖、覃糖、血清菊糖及甘露醇，不能分解棉子糖，對(duì)七葉苷、山梨醇、馬尿酸鈉、水楊素與6.5%Na肉湯反應(yīng)為陰性。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4.1 分離菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

用細(xì)菌16S引物對(duì)提取的細(xì)菌核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增得到約1 500 bp左右的基因片段。

圖2 分離菌凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 金黃色葡萄球菌B10S1912180611Q株的同源性分析

將測(cè)序得到的序列進(jìn)行拼接后命名為B10S1912180611Q株，運(yùn)用DNAStar程序?qū)⑵渑cGenBank中收錄胸膜肺炎放線桿菌（NR044752）、副豬嗜血桿菌（AB078972）、巴氏桿菌（NR118747）、多殺巴斯德氏菌（NR115137）、鏈球菌（NR037096）、葡萄球菌（MW282888）等15株參考株進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其與金黃色葡萄球菌S.aureus LZS-003（MW282888）、S.aureus ATCC 12600（NR115606）和S.aureus NBRC 100910（NR113956）菌株相似性最高為100%，與鏈球菌（NR037096）相似性最低為75.1%（如圖3所示）。

圖3 B10S1912180611Q株相似性分析

運(yùn) 用MEGA5軟 件 將B10S1912180611Q株與15株參考菌株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)其與金黃色葡萄球菌S.，aureus LZS-003（MW282888）、S.aureus ATCC 12600（NR115606）和 S.aureus NBRC 100910（NR113956）菌株同源性最高為100%處于同一進(jìn)化細(xì)分支，遺傳關(guān)系最近，與鏈球菌（NR037096）處于不同的進(jìn)化大分支，遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)（如圖4所示）。

圖4 B10S1912180611Q株遺傳進(jìn)化分析

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將純化培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，經(jīng)23 h培養(yǎng)后各藥敏紙片出現(xiàn)大小不一抑菌圈，記錄結(jié)果（如表2所示），參考M100抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）2020版，以抑菌圈的直徑大小進(jìn)行結(jié)果判定，發(fā)現(xiàn)該分離菌株對(duì)青霉素G、氨芐西林、氯霉素、多西環(huán)素、克林霉素及痢特靈等藥物完全耐藥，對(duì)氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素等藥物也有耐藥性，對(duì)部分頭孢及人工青霉素較為敏感，對(duì)麥迪霉素表現(xiàn)為高度敏感。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種人獸共患的致病菌，哺乳期仔豬常因皮膚破損而感染該菌，導(dǎo)致皮膚愈合不良，有部分產(chǎn)毒素和致病因素的金黃色葡萄球菌，在動(dòng)物感染后會(huì)導(dǎo)致敗血癥、創(chuàng)傷愈合不全、腸內(nèi)炎癥和休克綜合征等。有研究表明金黃色葡萄球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)抗生素、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素、喹諾酮類(lèi)抗生素、氨基糖苷類(lèi)抗生素、四環(huán)素抗生素有一定的耐藥性，在臨床上豬只感染該病原菌，用藥防治方面藥敏試驗(yàn)顯得非常重要。本次試驗(yàn)通過(guò)病豬的組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)后，得到的表面光滑、濕潤(rùn)、微隆、大小中等的單一菌落，邊緣整齊。對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)后革蘭氏染色鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)紫色似葡萄串狀排列的球菌，少許為單、雙個(gè)或鏈狀排列。生化鑒定試驗(yàn)中，該菌株可以分解乳糖、覃糖、血清菊糖及甘露醇，不能分解棉子糖，對(duì)七葉苷、山梨醇、馬尿酸鈉、水楊素與6.5%Na肉湯反應(yīng)為陰性。本試驗(yàn)分離鑒定得到的細(xì)菌生長(zhǎng)特性及生化鑒定結(jié)果符合金黃色葡萄球菌特性，初步確定該豬可能感染了金黃色葡萄球菌。同時(shí)，用細(xì)菌16S通用引物擴(kuò)增得到1 394 bp基因序列，將其與Genbank收錄的15株細(xì)菌參考基因序列進(jìn)行相似性和遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)分離菌株B10S1912180611Q與金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus LZS-003、Staphylococcus aureus ATCC 12600、Staphylococcus aureus NBRC 100910等菌株相似性最高為100%，且遺傳進(jìn)化處于同一分支，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明分離菌株為金黃色葡萄球菌。

在分離鑒定后對(duì)該株金黃色葡萄球菌進(jìn)行30種藥片的藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)青霉素G、氨芐青霉素、氯霉素、多西環(huán)素、氯潔霉素（克林霉素）、痢特靈（硝基呋喃類(lèi)）、萬(wàn)古霉素的抑菌圈直徑為0，表示該菌株對(duì)部分青霉素類(lèi)（青霉素G、氨芐西林）、廣譜類(lèi)藥物（氯霉素、多西環(huán)素、克林霉素等）及硝基呋喃等藥物完全耐藥，甚至對(duì)萬(wàn)古霉素也已經(jīng)不敏感了。其對(duì)氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素等藥物基本具有耐藥性，對(duì)新霉素、慶大霉素兩種藥物中度敏感，而對(duì)阿米卡星、四環(huán)素及卡那霉素等藥物表現(xiàn)耐藥；對(duì)部分頭孢及人工合成的青霉素較為敏感，對(duì)麥迪霉素表現(xiàn)高度敏感。在臨床感染金黃色葡萄球菌的病豬，可先考慮麥迪霉素、頭孢及人工青霉素，如頭孢呋新、頭孢三嗪（菌必治）、卡比西林等，也可用環(huán)丙沙星、慶大霉素等中度敏感的藥物進(jìn)行治療。有研究報(bào)道，治療金黃色葡萄球菌感染時(shí)，選用慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺等抗菌藥效果較好，通過(guò)選擇慶大霉素、環(huán)丙沙星進(jìn)行治療得到了良好效果，這與本試驗(yàn)的選藥建議基本符合。關(guān)于金黃色葡萄球菌耐藥性的變異及傳播，有研究證明這可能與來(lái)源于人類(lèi)和不同動(dòng)物的金黃色葡萄球菌tet（M）基因有關(guān)。