王夢(mèng)蕊，劉淑梅，侯麗霞，王施慧，呂宏君，蘇曉梅

番茄頸腐根腐病抗性鑒定技術(shù)的建立及抗性種質(zhì)資源篩選

王夢(mèng)蕊1,2，劉淑梅1，侯麗霞1，王施慧1，呂宏君1，蘇曉梅1

1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家蔬菜改良中心山東分中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站（山東），濟(jì)南 250100；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193

【】探索番茄頸腐根腐?。‵usarium crown and root rot，F(xiàn)CRR）苗期抗性鑒定技術(shù)，并對(duì)番茄種質(zhì)資源及品種進(jìn)行抗性鑒定分析，挖掘和豐富可利用的抗性資源，為培育抗頸腐根腐病番茄品種打下基礎(chǔ)。以尖鐮孢番茄頸腐根腐病?；筒≡╢. sp.，F(xiàn)orl）和感病栽培番茄Heinz 1706為材料，研究接種菌液濃度、接種寄主苗齡、接種后管理溫度和不同接種方法對(duì)番茄頸腐根腐病人工接種鑒定效果的影響。隨后通過苗期人工接種鑒定方法結(jié)合文獻(xiàn)中已報(bào)道的與抗性基因連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)100份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行頸腐根腐病抗性鑒定分析。在一定范圍內(nèi)，番茄頸腐根腐病發(fā)病率及病情指數(shù)隨著接種菌液濃度的升高而增大，接種菌液濃度為107個(gè)孢子/mL時(shí)，發(fā)病率及病情指數(shù)分別為100%和89.2，可以反映寄主真實(shí)的抗性水平；接種寄主苗齡為2—5葉期均能使植株發(fā)病，不同苗齡間病情指數(shù)無顯著差異；接種后不同的管理溫度對(duì)番茄頸腐根腐病的病情指數(shù)影響顯著不同，其中較低的管理溫度（20℃）有利于番茄頸腐根腐病的發(fā)生；使用浸根法和灌根法進(jìn)行鑒定，番茄頸腐根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)較高且效果穩(wěn)定，顯著優(yōu)于莖注射法。對(duì)100份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行分析，接種鑒定結(jié)果顯示有38份材料表現(xiàn)抗病，這些材料可用于番茄抗頸腐根腐病育種或生產(chǎn)。在已報(bào)道的與連鎖的分子標(biāo)記中，SCAR的準(zhǔn)確率最低，僅為51%，C2-25的準(zhǔn)確率為59%，而PNU-D4的準(zhǔn)確率為83%，該標(biāo)記可用于番茄抗頸腐根腐病輔助選擇。建立的苗期抗性鑒定技術(shù)能客觀反映供試材料的實(shí)際抗性水平，可用于番茄抗頸腐根腐病材料的鑒定篩選。

番茄；頸腐根腐??；抗性鑒定；分子標(biāo)記

0 引言

【研究意義】番茄頸腐根腐?。‵usarium crown and root rot，F(xiàn)CRR）是由尖鐮孢番茄頸腐根腐病專化型（f. sp.，F(xiàn)orl）引起的番茄土傳性真菌病害[1-2]。該病害在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生[3-8]，設(shè)施栽培地區(qū)較為嚴(yán)重，在連作栽培區(qū)造成的損失逐年加大，是設(shè)施番茄生產(chǎn)的限制因素之一[9-10]?？乖床牧系睦檬强共∮N的前提和基礎(chǔ)，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定和篩選，對(duì)于抗性基因的克隆以及加速番茄抗頸腐根腐病育種進(jìn)程具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，番茄頸腐根腐病已成為威脅我國設(shè)施番茄冬春生產(chǎn)的最重要的病害之一，侵染后可造成番茄嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收[11-15]。我國東北、華北地區(qū)發(fā)病比較嚴(yán)重，尤以山東省壽光地區(qū)病情最為突出。據(jù)調(diào)查，壽光日光溫室番茄頸腐根腐病發(fā)病率達(dá)80%以上，致死率達(dá)30%以上[12]，給當(dāng)?shù)厣a(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。培育和利用抗病品種是控制該病害最為經(jīng)濟(jì)、有效的措施，抗性鑒定是抗病育種的基礎(chǔ)工作，也是抗源篩選、挖掘和利用的前提條件。國外開展頸腐根腐病抗性鑒定及抗源篩選利用工作較早，并且在抗性基因研究和分子標(biāo)記應(yīng)用方面也取得了一定的進(jìn)展[16-21]，然而不同研究者得到的結(jié)果也并不一致，其中STANIASZEK等[18]根據(jù)與緊密連鎖的保守序列位點(diǎn)C2_At2g38025設(shè)計(jì)的CAPS標(biāo)記C2-25應(yīng)用最為廣泛?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我國有關(guān)番茄抗頸腐根腐病的研究報(bào)道較少，多數(shù)集中在對(duì)病原菌的鑒定以及防治措施的簡單描述，在頸腐根腐病抗性鑒定及抗源篩選方面的工作相對(duì)落后，抗病育種工作進(jìn)展也較為緩慢[22-25]。在不同的室內(nèi)條件下，使用不同的接種方法產(chǎn)生的效果也不盡相同，因此建立一套快速、高效、穩(wěn)定并且適用于大批量試材的抗性鑒定技術(shù)十分必要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以高感頸腐根腐病的栽培番茄Heinz 1706為材料，研究人工接種番茄頸腐根腐病的最佳條件，為番茄抗頸腐根腐病材料的選育提供切實(shí)可行的鑒定技術(shù)，同時(shí)利用苗期人工接種鑒定技術(shù)結(jié)合分子標(biāo)記分析，對(duì)收集的100份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行抗頸腐根腐病鑒定，明確其抗病水平，為番茄抗頸腐根腐病育種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

抗病鑒定技術(shù)所用材料為高感頸腐根腐病的番茄品系Heinz 1706，抗性種質(zhì)資源篩選材料共100份，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄課題組收集保存，包括49份自交系材料和51份雜交種。以上材料均選取粒飽滿無病種子，10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min消毒處理，清洗后在28℃恒溫箱中催芽，待露白后播種于滅菌的基質(zhì)土中。試驗(yàn)于2020年8月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，苗期控制室內(nèi)溫度24—28℃，正常栽培管理。

供試病原菌采集于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所核心試驗(yàn)區(qū)溫室內(nèi)，采用組織分離法進(jìn)行分離純化，經(jīng)鑒定為尖鐮孢番茄頸腐根腐病專化型，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將培養(yǎng)在PDA平板培養(yǎng)基上的病原菌接種于盛有150 mL PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，25℃下140 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)液經(jīng)過濾除去菌絲體后4 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，加滅菌蒸餾水稀釋成一定濃度的接種懸浮液。

1.2.2 不同接種條件試驗(yàn) 不同接種菌液濃度：當(dāng)番茄長至2—3片真葉時(shí)，使用濃度為106、107、108個(gè)/mL的孢子懸浮液，采用浸根法對(duì)番茄幼苗進(jìn)行接種。不同寄主苗齡：采用浸根法，使用濃度為107個(gè)/mL的孢子懸浮液對(duì)2—3、3—4、4—5葉期的番茄幼苗進(jìn)行接種。不同管理溫度：采用浸根法，使用濃度為107個(gè)/mL的孢子懸浮液對(duì)2—3葉期的番茄幼苗進(jìn)行接種后，將其分別置于20、25、30℃環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

不同接種方法：當(dāng)番茄長至2—3片真葉時(shí)，使用濃度為107個(gè)/mL的孢子懸浮液進(jìn)行接種。浸根法：將番茄幼苗從穴盤中輕輕拔起后用水洗掉根部泥土，把主根尖端剪去0.5 cm左右后，將幼苗的根系在菌懸液中浸泡15 min，然后移栽至滅菌的育苗基質(zhì)中[20-21]。灌根法：當(dāng)番茄長至2—3片真葉時(shí)，在幼苗根部一側(cè)用刀片將部分根輕輕切斷，給根系造成機(jī)械傷害，將濃度為107個(gè)/mL孢子懸浮液30 mL灌入傷根部位[14]。莖基部注射法：用注射器吸取0.1 mL病原菌孢子懸浮液，由番茄幼苗的莖基部刺入并將接種菌液注射到番茄幼苗莖基部木質(zhì)部，每株注射兩處[26]。

試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)10株苗，4周后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.3 番茄種質(zhì)資源抗病性鑒定 當(dāng)番茄幼苗長至2—3葉期時(shí)，用清水將根系清洗干凈后剪去主根尖端0.5 cm，放在濃度為107個(gè)/mL的孢子懸浮液中浸根處理15 min，然后移栽至滅菌基質(zhì)土中，對(duì)照組用清水浸根處理，接種后置于18—22℃室內(nèi)環(huán)境中，16 h·d-1光照條件，4周后調(diào)查發(fā)病情況。試驗(yàn)設(shè)置2次重復(fù)，每重復(fù)8株苗。病情分級(jí)（disease- severity scale，DSS）按照Kim等[20]的標(biāo)準(zhǔn)稍作修改。0級(jí)：根系正常；1級(jí)：主根基部輕微褐變，側(cè)根正常，莖縱剖維管束正常；2級(jí)：主根基部褐變，側(cè)根輕微褐變，莖縱剖維管束褐變；3級(jí)：主根側(cè)根明顯褐變，側(cè)根脫落，莖縱剖維管束明顯褐變；4級(jí)：植株萎蔫死亡或莖基部、根部嚴(yán)重褐變甚至腐爛，側(cè)根脫落，莖縱剖維管束嚴(yán)重褐變（圖1）。病情指數(shù)（disease index，DI）=[Σ（病級(jí)數(shù)值×該病級(jí)株數(shù)）]/（病級(jí)最高值×調(diào)查株數(shù)）×100。寄主抗性等級(jí)為免疫：DI =0；高抗：0＜DI＜12.5；抗?。?2.5≤DI＜25；中抗：25≤DI＜50；感病：50≤DI＜75；高感：75≤DI≤100。

1.2.4 番茄種質(zhì)資源分子標(biāo)記檢測(cè) 當(dāng)番茄長至2—3片真葉時(shí)，每個(gè)編號(hào)混合取樣，采用CTAB法提取基因組DNA，使用文獻(xiàn)中已報(bào)道的與連鎖的分子標(biāo)記及功能標(biāo)記對(duì)收集的番茄種質(zhì)材料進(jìn)行標(biāo)記分析（表1）。PCR擴(kuò)增體系為10 μL：50 ng·μL-1DNA模板2 μL，2×PCR mix 5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。引物C2-25、Tm-2和PNU-D4的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

a：0級(jí)DSS-0；b：1級(jí)DSS-1；c：2級(jí)DSS-2；d：3級(jí)DSS-3；e：4級(jí)DSS-4

表1 番茄頸腐根腐病抗性基因（Frl）分子標(biāo)記

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同接種條件對(duì)人工接種鑒定效果的影響

2.1.1 接種菌液濃度 不同接種菌液濃度下，番茄幼苗頸腐根腐病病情指數(shù)差異極顯著。接種菌液濃度為106個(gè)/mL時(shí)，病情指數(shù)為66.7，發(fā)病率為90%，試驗(yàn)所用高感材料部分表現(xiàn)為抗病，不能真實(shí)反映植株本身的抗性。隨著菌液濃度的增加，病情指數(shù)也隨之增加，接種菌液濃度為107、108個(gè)/mL時(shí)，病情指數(shù)分別為89.2和96.7，發(fā)病率均為100%，能夠真實(shí)反映材料本身的抗病性（表2）。

2.1.2 接種寄主苗齡 2—3、3—4、4—5葉期進(jìn)行人工接種，番茄均可發(fā)病，發(fā)病率均為100%。隨著苗齡的增加，病情指數(shù)略有下降，2—3片真葉時(shí)發(fā)病最重，病情指數(shù)為91.7，但不同苗齡接種對(duì)病情指數(shù)影響差異并不顯著（表2）。

表2 不同接種條件對(duì)人工接種鑒定效果的影響

數(shù)據(jù)后不同大、小寫字母分別表示經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)在= 0.01和= 0.05水平差異顯著

Different capital and lowercase letters after the data indicate significant differences at 0.01 and 0.05 levels by DMRT, respectively

2.1.3 接種后管理溫度 番茄幼苗植株接種頸腐根腐病病原菌后，在不同的溫度環(huán)境中發(fā)病率均為100%，在20℃時(shí)病情指數(shù)最高，隨著溫度的上升，病情指數(shù)也隨之下降，差異極顯著，表明接種后較低的管理溫度有利于番茄頸腐根腐病的發(fā)生（表2）。

2.1.4 接種方法 采用不同的接種方法，番茄發(fā)病情況有所不同。使用浸根法和灌根法進(jìn)行鑒定，番茄頸腐根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)較高，顯著優(yōu)于莖注射法（表2）。

2.2 番茄種質(zhì)資源接種鑒定

采用苗期人工接種鑒定方法對(duì)100份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行抗頸腐根腐病鑒定，其中高代自交系49份，雜交種51份。接種后4周進(jìn)行病情分級(jí)調(diào)查，計(jì)算病情指數(shù)并確定材料抗性級(jí)別。鑒定結(jié)果如表3所示，在49份高代自交系材料中，抗病種質(zhì)有12份，包括來自TGRC含的5份抗源材料LA1791、LA2829、LA3273、LA3292和LA3471，以及課題組篩選的3份砧木材料ZM-4、ZM-6和ZM-7。在51份雜交種中，表現(xiàn)抗病的品種有26份，包括來自偉麗公司的5份砧木以及不同單位或公司選育的商業(yè)栽培品種。

2.3 番茄種質(zhì)資源分子標(biāo)記檢測(cè)

對(duì)100份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)（圖2），不同標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與人工接種鑒定結(jié)果有所差異。改良C2-25標(biāo)記準(zhǔn)確率為59%，PNU-D4標(biāo)記的準(zhǔn)確率為83%，而改良SCAR標(biāo)記準(zhǔn)確率僅為51%（表3）；Tm-2（I）標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示，有37份材料攜帶了純合，37份材料攜帶了雜合。

M：DNA ladder，100 bp；R：抗病型resistant；S：感病型susceptible；H：雜合型heterozygous

表3 番茄種質(zhì)資源人工接種鑒定與分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

IL：自交系inbred line；CAAS：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院Chinese Academy of Agricultural Sciences；SAAS：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院Shandong Academy of Agricultural Sciences；WAAS：溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院Wenzhou Academy of Agricultural Sciences；WDT：宛東番茄Wandong Tomato；WLS：偉麗種苗Weili Seeding；

DSS：病情分級(jí)Disease-severity scale；DI：病情指數(shù)Disease index；RT：抗病等級(jí)Resistance type；I：免疫Immune；HR：高抗Highly resistant；R：抗病Resistant；MR：中抗Moderately resistant；S：感病Susceptible；HS：高感Highly susceptible。H：雜合（分子標(biāo)記一欄）Heterozygous (the column of molecular marker) a：已知含有的抗源材料Resistant material known to contain the；b：生產(chǎn)中已知抗病商業(yè)品種Resistant commercial varieties known in production

3 討論

3.1 番茄頸腐根腐病苗期抗性鑒定技術(shù)體系的建立

苗期人工接種鑒定是種質(zhì)資源抗病性鑒定的重要方法之一，其優(yōu)點(diǎn)在于可以有效控制環(huán)境因子，且保證寄主只被單一病原菌侵染，同時(shí)能夠避免因病原菌蔓延而造成的生產(chǎn)影響，因此得到育種工作者的普遍重視。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著接種菌液濃度的升高，番茄頸腐根腐病病情指數(shù)增加，當(dāng)菌液濃度為107—108個(gè)/mL時(shí)接種效果明顯，能夠真實(shí)反映番茄幼苗抗性?？紤]到108個(gè)/ml的孢子懸浮液制備需大量搖菌，因此接種菌液濃度為107個(gè)/ml即可。在番茄2—5葉期，接種頸腐根腐病原菌后均能發(fā)病，但差異并不明顯，其中2—3葉期接病效果稍好，這可能是幼苗接種苗齡越大，植物本身的抗性越強(qiáng)，病情指數(shù)就會(huì)越低，并且在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，接種苗齡越大，發(fā)病時(shí)間也會(huì)隨之推遲。另外試驗(yàn)結(jié)果表明，在接種病原菌之后的不同溫度環(huán)境中，番茄頸腐根腐病的發(fā)病情況不同。當(dāng)溫度在20℃左右時(shí)，番茄頸腐根腐病發(fā)生情況較重，表明該病原菌適宜較低的土壤溫度[27]，這也可能是該病常發(fā)生于冬春低溫季節(jié)的原因之一[11]。采用不同的人工接種方法，番茄頸腐根腐病發(fā)病情況有所不同。浸根法和灌根法相較于注射法效果較好，浸根法操作技術(shù)要求相對(duì)較低，菌液可以多次使用，對(duì)菌液量要求少，適合大規(guī)模的抗性資源篩選，該方法也是眾多研究者普遍使用的接種鑒定方法；而灌根法是在李瀟等[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，對(duì)植株根系進(jìn)行處理后使其存在傷口而更容易被病原菌侵染，該方法省時(shí)省力，但對(duì)菌液數(shù)量要求極大，適合對(duì)少量材料進(jìn)行接種鑒定；注射法操作技術(shù)要求較高，且病情指數(shù)不同重復(fù)間偏差較大，推測(cè)可能是因?yàn)樽⑸溥M(jìn)幼苗莖基部的菌液溢出，導(dǎo)致無法定量每個(gè)單株注射的菌液，從而影響試驗(yàn)結(jié)果，另外不同操作者產(chǎn)生的效果也可能不同，因此該方法并不適合大批量材料的鑒定。本試驗(yàn)使用苗期人工接種鑒定方法對(duì)100份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行抗頸腐根腐病鑒定，其中有38份材料對(duì)番茄頸腐根腐病表現(xiàn)抗性。盡管室內(nèi)苗期接種鑒定具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但經(jīng)該方法篩選獲得的抗性材料仍需要進(jìn)一步在田間進(jìn)行鑒定，以明確其在生產(chǎn)環(huán)境中的抗性表現(xiàn)。

3.2 Frl分子標(biāo)記的應(yīng)用與分析

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已成為番茄育種過程中不可或缺的一種輔助手段，可以有效加速育種進(jìn)程，然而其準(zhǔn)確性取決于分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖程度。國內(nèi)外研究者在分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用方面做了很多工作。最初應(yīng)用于育種篩選的是由C2_At2g38025標(biāo)記改造的CAPS標(biāo)記C2-25[18]。程琳等[12]用人工接種鑒定病原菌的方法對(duì)25份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行抗病性鑒定，并使用分子標(biāo)記C2-25對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明人工病原菌接種鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果高度吻合，吻合率達(dá)100%。然而在本試驗(yàn)中，該標(biāo)記的準(zhǔn)確率僅為59%，其原因可能在于前人研究試驗(yàn)中所檢測(cè)的材料均引自荷蘭，其遺傳背景較為單一，因此分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與人工接種鑒定結(jié)果高度吻合。而本試驗(yàn)中的材料為收集保存的自然群體及不同來源的新品種，其遺傳背景較為復(fù)雜，因此該標(biāo)記準(zhǔn)確率較低。Mutlu等利用抗病材料Fla.7781構(gòu)建群體，篩選獲得了一個(gè)SCAR標(biāo)記SCAR，該標(biāo)記距離僅0.016 cM，位于9號(hào)染色體的61.8 Mb位置[19]，與標(biāo)記C2-25的物理位置較遠(yuǎn)，然而Kim等[20]驗(yàn)證了標(biāo)記SCAR在43份商品種中準(zhǔn)確率不到45%，與本試驗(yàn)中該標(biāo)記51%的準(zhǔn)確率較為相近。Kim等篩選的標(biāo)記PNU-D4，在F2群體及60份商品種番茄中的準(zhǔn)確率分別為92.8%和90%[20]，在本試驗(yàn)中該標(biāo)記的準(zhǔn)確率為83%，可用于番茄抗頸腐根腐病的分子標(biāo)記輔助選擇。

研究表明番茄抗煙草花葉病毒基因與緊密連鎖[16]，在本試驗(yàn)鑒定的38份抗頸腐根腐病的材料中，有31份同時(shí)攜帶，這些材料可用于番茄抗病育種或商業(yè)生產(chǎn)。另有研究表明較早應(yīng)用到抗病育種中的秘魯番茄PI128650同時(shí)攜帶抗病基因和，研究者對(duì)300多份栽培番茄材料基因組重測(cè)序，通過與PI128650基因組相似性比較發(fā)現(xiàn)，其中20個(gè)個(gè)體攜帶有秘魯番茄9號(hào)染色體長約51.7—54.7 Mb的部分片段，該外源野生片段占據(jù)了番茄9號(hào)染色體的大部分區(qū)域[28]。由于野生番茄和栽培種番茄存在結(jié)構(gòu)變異[29-30]，在長期的自交和回交育種過程中，該外源片段依舊沒有完全被打斷。而在本試驗(yàn)中，標(biāo)記Tm-2和標(biāo)記SCAR的分析結(jié)果中二者的吻合率為92%，表明該染色體區(qū)間緊密連鎖，這與前人的研究結(jié)果一致。

到目前為止，對(duì)于的定位和分子標(biāo)記的應(yīng)用，不同研究者的結(jié)果并不一致，特別是不同標(biāo)記在商品種中驗(yàn)證的準(zhǔn)確率往往有很大差別，其原因可能在于不同商品種的遺傳背景不同，不同研究者所檢測(cè)的商品種來源不一，其遺傳背景在很大程度上會(huì)影響標(biāo)記的準(zhǔn)確率。另外，在本次鑒定的100份材料中，有12份材料（TS-211、TS-272、SD-16、Ah2001、Ah2003、Ah2013、金棚8號(hào)、飛躍、甌秀806、百利、天祿1號(hào)、傳奇）人工接種鑒定結(jié)果均為高感，而分子標(biāo)記檢測(cè)均為抗病，其原因除了遺傳背景差異造成的影響外，還可能在于外源野生片段在轉(zhuǎn)育到栽培種的過程中，該基因內(nèi)部發(fā)生某些突變導(dǎo)致功能喪失，而本研究中所使用的標(biāo)記均為連鎖標(biāo)記，因此二者鑒定結(jié)果不吻合。只有開發(fā)基因內(nèi)部的功能標(biāo)記才能提高選擇效率，因此該基因的定位克隆及分子標(biāo)記輔助育種研究仍是當(dāng)前亟待解決的重大科學(xué)和生產(chǎn)實(shí)際問題。

4 結(jié)論

建立了適用于大批量番茄頸腐根腐病苗期抗性鑒定的技術(shù)，即當(dāng)番茄長至2—3片真葉時(shí)，使用濃度為107—108個(gè)/mL的病原菌孢子懸浮液，采用浸根法進(jìn)行接種，接種后管理溫度為20℃左右，4周后調(diào)查發(fā)病情況。同時(shí)，對(duì)收集的100份番茄材料進(jìn)行了接種鑒定及分子標(biāo)記分析，明確了其抗性，這些材料可用于番茄抗頸腐根腐病育種或生產(chǎn)。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所、宛東番茄科技（廣州）有限公司、山東偉麗種苗有限公司提供的部分資源材料。

[1] JARVIS W R, SHOEMAKER R A. Taxonomic status ofcausing foot and root rot of tomato. Phytopathology, 1978, 68: 1679-1680.

[2] SZCZECHURA W, STANIASZEK M, HABDAS H.f. sp.——the cause of fusarium crown and root rot in tomato cultivation. Journal of Plant Protection Research, 2013, 53(2): 172-176.

[3] SONODA R M. The occurrence of a Fusarium root rot of tomatoes in South Florida. Plant Disease Reporter, 1976, 60(3): 271-274.

[4] KRIKUN J, NACHMIAS A, COHN R, LAHKIM-TSROR L. The occurrence of Fusarium crown and root rot of tomato in Israel. Phytoparasitica, 1982, 10(2): 113-115.

[5] BRAMMALL R. Occurrence of fusarium crown and root rot of tomato in New Brunswick, Canada. Plant Disease, 1990, 74(12): 24-28.

[6] MCGOVERN R J, VAVRINA C S, NOLING J W, DATNOFF L A, YONCE H D. Evaluation of application methods of metam sodium for management of Fusarium crown and root rot in tomato in Southwest Florida. Plant Disease, 1998, 82(8): 919-923.

[7] CAN C, YUCEL S, KOROLEV N, KATAN T. First report of fusarium crown and root rot of tomato caused byf. sp.in Turkey. Plant Pathology, 2004, 53(6): 814.

[8] MALATTRAKIS N E. Tomato crown and root rot caused byf. sp.in Greece. Plant Pathology, 1985, 34(3): 438-439.

[9] JARVIS W R, THORPE H J, MELOCHE R B. Survey of greenhouse management practices in Essex County, Ontario, in relation to Fusarium foot and root rot of tomato. Plant Disease, 1983, 67(1): 38-40.

[10] KIM J T, PARK I H, HAHM Y, YU S H. Crown and root rot of greenhouse tomato caused byf. spin Korea. Plant Pathology Journal, 2001, 17(5): 290-294.

[11] 耿麗華, 李常保, 遲勝起, 王麗君, 柴敏. 番茄頸腐根腐病病原鑒定及不同條件對(duì)其生長的影響. 植物病理學(xué)報(bào), 2012, 42(5): 449-455.

GENG L H, LI C B, CHI S Q, WANG L J, ChAI M. Identification of the pathogen causing Fusarium crown and root rot of tomato and its growth affecting factors. Acta Phytopathologica Sinica, 2012, 42(5): 449-455. (in Chinese)

[12] 程琳, 張生, 李艷青, 陳福東, 程斐, 張曉艷, 董甜, 國家進(jìn). 番茄頸腐根腐病病原菌鑒定與抗病種質(zhì)材料的篩選. 園藝學(xué)報(bào), 2016, 43(4): 781-788.

CHENG L, ZHANG S, LI Y Q, CHEN F D, CHENG F, ZHANG X Y, DONG T, GUO J J. Pathogen identification of fusarium crown root rot and screening for resistant sources in tomato. Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43(4): 781-788. (in Chinese)

[13] 張尚卿, 韓曉清, 繆作清, 吳志會(huì), 張立嬌. 番茄頸腐根腐病病原鑒定及2種接種方法的評(píng)價(jià). 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2017, 32(5): 124-129.

ZHANG S Q, HAN X Q, MIU Z Q, WU Z H, ZHANG L J. Pathogen identification and two inoculation methods of fusarium crown and root rot. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2017, 32(5): 124-129. (in Chinese)

[14] 李瀟, 李雪萍, 漆永紅, 郭成, 李敏權(quán). 番茄頸腐根腐病病原鑒定及其品種抗性鑒定. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 54(5): 121-127.

LI X, LI X P, QI Y H, GUO C, LI M Q. Identification and variety resistance of the pathogen of tomato crown and root rot. Journal of Gansu agricultural university, 2019, 54(5): 121-127. (in Chinese)

[15] 王家哲, 任平, 張鋒, 洪波, 常青, 劉晨, 楊藝煒, 王遠(yuǎn)征, 李英梅, 付博. 溫室大棚番茄頸腐根腐病病原菌的分離鑒定//中國植物保護(hù)學(xué)會(huì)2019年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集, 2019: 68-73.

WANG J Z, REN P, ZHANG F, HONG B, CHANG Q, LIU C, YANG Y W, WANG Y Z, LI Y M, FU B. Isolation and identification of the pathogen of Fusarium crown and root rot of tomato in greenhouse// Proceedings of the 2019 annual meeting of the Chinese society of plant protection, 2019: 68-73. (in Chinese)

[16] VAKALOUNAKIS D J, LATERROT H, MORETTI A, LIGOXIGAKIS E K, SMARDAS K. Linkage between(f. sp.resistance) and(tobacco mosaic virus resistance-2) loci in tomato (). Annals of Applied Biology, 1997, 130(2): 319-323.

[17] FAZIO G, STEVENS M R, SCOTT J W. Identification of RAPD markers linked to fusarium crown and root rot resistance () in tomato. Euphytica, 1999, 105(3): 205-210.

[18] STANIASZEK M, SZCZECHURA W, MARCZEWSKI W. Identification of a new molecular marker C2-25 linked to thef. sp.resistancegene in tomato. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 2014, 50(4): 285-287.

[19] MUTLU N, DEMIRELLI A, ILBI H, IKTEN C. Development of co-dominant SCAR markers linked to resistant gene against thef. sp.. Theoretical and Applied Genetics, 2015, 128(9): 1791-1798.

[20] KIM B, KIM N, KIM J Y, KIM B S, JUNG H J, HWANG I, NOUA I S, SIM S C, PARK Y. Development of a high-resolution melting marker for selecting Fusarium crown and root rot resistance in tomato. Genome, 2016, 59(3): 173-183.

[21] DEVRAN Z, KAHCECI E, HONG Y, STUDHOLME D J, TOR M. Identifying molecular markers suitable forselection in tomato breeding. Theoretical and Applied Genetics, 2018, 131(10): 2099-2105.

[22] 劉蕾, 王輝. 番茄頸腐根腐病病原菌及抗病育種研究進(jìn)展. 長江蔬菜, 2016(6): 35-37.

LIU L, WANG H. Research progress of tomato fusarium crown and root rot pathogen and resistance breeding. Journal of Changjiang Vegetables, 2016(6): 35-37. (in Chinese)

[23] 李景富, 孫亞莉, 趙婷婷, 姜景彬, 許向陽. 番茄頸腐根腐病菌分離鑒定與生物學(xué)特性研究. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 49(2): 22-30.

LI J F, SUN Y L, ZHAO T T, JIANG J B, XU X Y. Separation identification and biological characteristics of pathogen causing Fusarium crown and root rot of tomato. Journal of Northeast Agricultural University, 2018, 49(2): 22-30. (in Chinese)

[24] 劉蕾, 王輝, 李文麗, 王富. 與番茄頸腐根腐病抗病基因連鎖的標(biāo)記及應(yīng)用. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(16): 91-93.

LIU L, WANG H, LI W L, WANG F. Application of the linkage markers with thegene conferring resistance to fusarium crown and root rot in tomato. Jiangsu Agricultural Sciences, 2018, 46(16): 91-93. (in Chinese)

[25] 杜建峰, 吳偉, 張曉英, 李洋, 丁新華. 番茄頸腐根腐病的發(fā)生及其防治研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2020, 36(10): 200-206.

DU J F, WU W, ZHANG X Y, LI Y, DING X H. Research progress on the occurrence and control of fusarium crown and root rot of tomato. Biotechnology bulletin, 2020, 36(10): 200-206. (in Chinese)

[26] 姜景彬, 許向陽, 孫亞莉, 李景富, 張賀, 楊歡歡, 趙婷婷. 一種番茄莖腐根腐病苗期快速接種鑒定方法: CN108841916A[P] (2018-11-20) [2021-07-23].

JIANG J B, XU X Y, SUN Y L, LI J F, ZHANG H, YANG H H, ZHAO T T.A method for rapid inoculation identification of Fusarium crown and root rot in tomato seedlings: CN108841916A[P] (2018-11- 20) [2021-07-23]. (in Chinese)

[27] MENZIES J G, KOVH C, SEYWERD F. Additions to the host range off. sp.. Plant Disease, 1990, 74(8): 569-572.

[28] LIN T, ZHU G, ZHANG J, XU X, YU Q, ZHENG Z, ZHANG Z, LUN Y, LI S, WANG X,. Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding. Nature Genetics, 2014, 46(11): 1220-1226.

[29] SEAH S, YAGHOOBI J, ROSSI M, GLEASON C A, WILLIAMSON V M. The nematode-resistance gene,, is associated with an inverted chromosomal segment in susceptible compared to resistant tomato. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 108(8): 1635-1642.

[30] JI Y, SCHUSTER D J, SCOTT J W., a begomovirus resistance locus near the tomato yellow leaf curl virus resistance locuson chromosome 6 of tomato. Molecular Breeding, 2007, 20(3): 271-284.

Development of artificial inoculation methodology for evaluation of resistance to Fusarium crown and root rot and screening of resistance sources in tomato

WANG MengRui1,2, LIU ShuMei1, HOU LiXia1, WANG ShiHui1, Lü HongJun1, SU XiaoMei1

1Institute of Vegetables, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Province Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables/Shandong Branch of National Improvement Center for Vegetables/Huanghuai Region Scientific Observation and Experimental Station of Vegetables (Shandong), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Ji’nan 250100;2College of Horticulture, China Agricultural University, Beijing 100193

】The objective of this study is to explore the resistance identification technology of Fusarium crown and root rot (FCRR), carry out the resistance identification and analysis of tomato germplasm resources and varieties, enrich the available tomato resources resistant to FCRR, and to lay the foundation for the cultivation of tomato varieties that resistant to FCRR.【】In the present study, four parameters that influence the inoculation effect including inoculum concentration, seedlings stage, environmental temperature and inoculation methods were studied using susceptible line Heinz 1706 infected withf. sp.(Forl). Subsequently, 100 tomato materials were identified through artificial inoculation at seedling stage as well as the molecular markers linked to the resistance gene.【】The disease incidence and disease index of FCRR increased in a certain range along with the increase of inoculum concentration, and the actual levels of plant resistance could be revealed with the inoculum of 107spores/mL, for which the disease incidence and disease index were 100% and 89.2, respectively. The disease index was not significantly different among different seedling ages when the host was inoculated at 2 to 5 leaf stage. The effects of different environmental temperatures after inoculation on the disease index of FCRR were significantly different and the lower temperature (20℃) condition was more favorable to the occurrence of FCRR.The incidence and disease indexwere higher and the effect was stable using root dipping and root irrigation methods, which were significantly better than stem injection. The result of inoculation identification suggested that 38 materials showed resistance to FCRR among 100 tomato materials, which could be used for breeding or production in tomato for FCRR resistance. In addition, among the reported markers linked to, SCARhas the lowest accuracy of 51%, while C2-25 has the accuracy of 59% and the accuracy of PNU-D4 is 83%, which is expected to be used in marker-assisted selection (MAS) for FCRR resistance.【】The established assessment system can identify levels of the resistance to FCRR in tomato seedlings, which can be used for identification and screening of tomato materials.

tomato; Fusarium crown and root rot (FCRR); resistance identification; molecular marker

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.007

2021-07-23；

2021-08-28

山東省自然科學(xué)基金（ZR2020QC152）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-23-G13）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程（2020LZGC005）

王夢(mèng)蕊，E-mail：wangmr151@qq.com。劉淑梅，E-mail：lsmei78@126.com。王夢(mèng)蕊和劉淑梅為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者蘇曉梅，Tel：0531-66659184；E-mail：sxm198846@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）