蘇靜華，焦 婷，韓 寧，蘇靜克，黨瑞杰，李 琳，張海松

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，30%～40%的糖尿病患者可出現(xiàn)腎臟損害。蛋白尿是DN主要的臨床表現(xiàn)，是由腎小球濾過屏障損害造成的。腎小球濾過屏障包括內(nèi)皮細胞、基底膜和足細胞，而足細胞對于維持腎小球濾過屏障的完整性至關重要。足細胞相關蛋白，如Nephrin、podocin等，構成了腎小球濾過屏障的分子篩，是保障濾過功能的重要分子屏障。這些足細胞相關蛋白的異常會損害過濾屏障結構的完整性和穩(wěn)定性，從而引起蛋白尿。細胞凋亡是足細胞數(shù)量減少的主要原因，而且足細胞是終末分化細胞，不能再生。因此，抑制高糖環(huán)境誘導的足細胞凋亡是防治DN的重要手段。

大麻二酚(cannabidiol, CBD)是無精神活性的天然大麻素類提取物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、改善睡眠和抗腫瘤等多種生物學效應。最近，動物實驗表明，CBD能抑制誘導糖尿病心肌病變的細胞死亡信號，CBD干預有助于降低1型糖尿病小鼠胰腺早期炎性反應，CBD能緩解高糖誘導的氧化應激損傷。但是，CBD能否抑制高糖誘導的足細胞凋亡尚不清楚。本研究以小鼠腎臟足細胞系MPC5為實驗對象，探討CBD對高糖環(huán)境中MPC5細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器 小鼠腎臟足細胞系MPC5，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物；1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco)；CBD(云南漢木森生物)；CCK-8檢測試劑盒(上海碧云天生物)；BCA(bicinchoninic acid)測定試劑盒(中國博邁德)；FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD)；預制膠電泳液(中國索萊寶)；PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美國Millipore)；脫脂奶粉(美國BD)；兔抗小鼠Nephrin抗體(稀釋比例1∶1000，武漢博士德)；Bax、Bcl-2抗體(稀釋比例1∶1000，美國Cell Signaling Technology)；小鼠β-肌動蛋白抗體(β-actin；稀釋比例1∶200，武漢博士德)。

Herocell 180型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(上海潤度生物)；2104 Envision型多功能酶標儀(美國PerkinElmer)；CytoFLEX 型流式細胞儀(美國 Beckman Coulter)；DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)；FlourChem FC12型凝膠成像分析儀(美國Alpha)。

1.2 細胞培養(yǎng) 將MPC5細胞復蘇后，加入含10%胎牛血清和50 U/ml的γ-干擾素的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(葡萄糖含量為5.5 mmol/L)，置于33 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中。當細胞鋪滿瓶底面積的70%～80%時，去除培養(yǎng)液中的γ-干擾素，將細胞轉移至37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中誘導分化1～2周。分化好的MPC5細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞增殖 將MPC5細胞接種到96孔板，分別加入30 mmol/L葡萄糖(high glucose, HG)和不同濃度的CBD(0.5、2.5、5 μM)。分別于接種后1～7 d，每天按照試劑盒說明書檢測細胞增殖活性(每組3個復孔)：每孔中加入10 μl CCK-8液，避光孵育2 h，于波長492 nm處檢測吸光度值(OD值)。因不同濃度的CBD可呈濃度依賴性地提高高糖環(huán)境中MPC5細胞的增殖活性且有飽和性。所以，后續(xù)實驗采用2.5 μM作為CBD的干預濃度。

1.4 細胞凋亡 將MPC5細胞分為3組：對照組(Vehicle)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖，HG)和CBD組(30 mmol/L葡萄糖+2.5 μM CBD)，各組細胞干預48 h后進行檢測。收集各組細胞的單細胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，分別混勻，于室溫下避光孵育10～15 min上機檢測。采用FlowJo 10.3軟件對實驗結果進行分析：左上象限(Q1)為細胞死亡百分比，右上象限(Q2)為晚期凋亡百分比，右下象限(Q3)為早期凋亡百分比，左下象限(Q4)為活細胞百分比，細胞凋亡率= Q2+Q3。

1.5 Western blot 細胞分組及處理時間同1.4細胞凋亡。取各組細胞，PBS緩沖液沖洗后加入細胞裂解液裂解細胞并提取總蛋白。取50 μg總蛋白上樣后，進行電泳。然后在220 mA的條件下轉膜2 h，再室溫封閉2 h，分別滴加特異性一抗封閉過夜，再以辣根過氧化物酶標記的二抗封閉2 h。最后，用化學發(fā)光劑染色、顯影并采用BandScan 5.0軟件分析膠片灰度。所有實驗至少重復3次。

2 結 果

2.1 CBD對高糖環(huán)境中小鼠腎臟足細胞系MPC5增殖的影響 如表1所示，與Vehicle組相比，HG組MPC5細胞的增殖活性顯著降低(<0.05)，而不同濃度的CBD干預呈濃度依賴性地提高高糖環(huán)境中MPC5細胞的增殖活性。而且，2.5 μM CBD與5 μM CBD提高MPC5細胞增殖活性的作用差異無統(tǒng)計學意義。因此，本研究采用2.5 μM作為后續(xù)實驗的干預濃度。

2.2 CBD對高糖環(huán)境中小鼠腎臟足細胞系MPC5細胞凋亡的影響 如圖1所示，與Vehicle組相比，HG組MPC5細胞的凋亡比例顯著增加[(25.27±2.15)%(8.43±0.70)%;<0.05]，而CBD干預能明顯降低MPC5細胞的凋亡比例，差異有統(tǒng)計學意義[(12.83±1.05)%(25.27±2.15)%;<0.05]。

2.3 CBD對高糖環(huán)境中小鼠腎臟足細胞系MPC5細胞Nephrin及凋亡相關蛋白表達的影響 如圖2和圖3所示，與Vehicle組相比，HG組MPC5細胞的裂孔膜蛋白Nephrin蛋白表達顯著降低，而CBD干預能明顯升高MPC5細胞Nephrin蛋白的表達(<0.05)。而且， HG組促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達比升高，與Vehicle組相比，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05)；而CBD干預能顯著降低高糖環(huán)境中MPC5細胞促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達比(<0.05)。

3 討 論

本研究以高糖環(huán)境中的小鼠腎臟足細胞系MPC5為研究對象，發(fā)現(xiàn)CBD能促進高糖環(huán)境中MPC5增殖，降低高糖誘導的MPC5細胞凋亡率并降低促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的表達比，還能促進裂孔膜蛋白Nephrin蛋白表達。

足細胞凋亡在DN發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。高糖環(huán)境中，活性氧產(chǎn)量增加，進而激活p38 MAPK信號途徑促進足細胞凋亡。而且，糖基化終末產(chǎn)物也能通過激活FOXO4的轉錄表達促進足細胞凋亡。本實驗也發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可誘導足細胞系MPC5細胞凋亡。在生理狀態(tài)下，細胞同時接受促凋亡信號和抗凋亡信號的刺激，只有這兩種信號處于動態(tài)平衡狀態(tài)，內(nèi)環(huán)境才能保持穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境中MPC5細胞促凋亡蛋白Bax的表達升高，同時抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低。Nephrin是表達于足細胞連接處的一種黏蛋白，構成足細胞裂孔膜的關鍵成分，對于維持腎小球的濾過屏障功能具有重要作用。而且，Nephrin表達下降也是蛋白尿形成的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境中，足細胞功能蛋白Nephrin的表達也發(fā)生了下調。

CBD是從植物大麻中提取的純天然成分，CBD主要通過兩種CBD受體CB1和CB2發(fā)揮胞內(nèi)作用。在生理狀態(tài)下，足細胞低表達CB1受體，高表達CB2受體。無論是1型糖尿病模型還是2型糖尿病模型中，足細胞均過表達CB1受體。與之相反，在人終末期DN病理標本中，足細胞CB2受體的表達卻明顯下調。動物實驗表明，CBD對DN具有潛在的保護作用。例如：CB1受體抑制藥利莫那班能預防肥胖ZDF大鼠蛋白尿產(chǎn)生，減少腎小球損傷，改善白蛋白肌酐比等。本研究發(fā)現(xiàn)，CBD對高糖環(huán)境中的足細胞具有直接的保護作用：(1)CBD干預緩解高糖對足細胞增殖的抑制作用；(2)CBD緩解高糖誘導的足細胞凋亡和促凋亡蛋白的表達并促進抗凋亡蛋白的表達；(3)CBD能促進高糖環(huán)境中足細胞功能蛋白Nephrin的表達。但是，CBD受體在CBD緩解高糖誘導的MPC5細胞凋亡中的作用本研究未進一步探討，這是本文的一個局限。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CBD可在體外抑制高糖誘導的小鼠足細胞系MPC5細胞凋亡，CBD有望被開發(fā)成抑制高糖環(huán)境中足細胞凋亡并進而緩解DN的一種潛在藥物。