喬 璐，楊 艷，唐代詩，杜 婷，顧 勇

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，主要來源于葡萄、花生和桑椹等植物，其中葡萄中含量較高。研究表明，白藜蘆醇具有降低血小板聚集、預防和治療動脈粥樣硬化的作用，同時還可以抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如食管癌、乳腺癌和肺癌等。目前，白藜蘆醇如何影響結腸癌的發(fā)生發(fā)展及其具體機制尚不明確。本文通過體外實驗研究白藜蘆醇對結腸癌細胞凋亡的影響及其對結腸癌細胞MyD88/TLR4/NF-kB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑 HT-29、sw480和 LoVo結腸癌細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。白藜蘆醇、VEGF、MyD88、TRL4、NF-kB、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3抗體均購于美國Santa Cruz公司。反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒與引物均購于日本寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞體外培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的結腸癌細胞(10/ml)培養(yǎng)在75 cm組織培養(yǎng)瓶，設定為：對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組(白藜蘆醇0、25、50、100 μmol/L)處理結腸癌細胞，處理時間為24 h。

1.2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡率 細胞培養(yǎng)后利用甲醛固定，加入0.1% Triton X-100通透細胞膜。根據(jù)TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書加入TUNEL反應混合液，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌后加入顯色液。陽性表達為凋亡細胞核呈棕褐色(正常細胞核為藍色)。每組實驗獨立重復3次，利用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析測量軟件分析，計數(shù)每張照片陽性表達面積及累積光密度。

1.2.3 ELISA法檢測細胞上清液中VEGF表達 收集各組處理后的對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后再4 ℃ 3000 r/min離心14 min，收集細胞上清液。參照ELISA試劑盒說明書檢測0、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇處理后結腸癌細胞內(nèi)VEGF表達變化，每組實驗獨立重復3次。

1.2.4 引物設計 檢索基因文庫中所要檢測目的基因的cDNA序列，應用引物設計軟件Primer 5.0設計引物(表1)，由日本寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.5 Western blot檢測 收集各組處理后的對數(shù)生長期的HT-29、sw480和 LoVo細胞蛋白，并用BCA法進行定量。各組各取30 μg樣品置于聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至PVDF膜。用2 ml的BSA封閉液封閉1 h，再加入2 ml MyD88、TLR4和NF-kB、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3和β-actin (1∶1000)一抗后4 ℃孵育過夜，次日通過ECL發(fā)光液進行顯影。

1.2.6 RT-PCR 根據(jù)Trizol說明書提取對照組和不同劑量白藜蘆醇處理組細胞中的總RNA，將提取的總RNA在65 ℃孵育5 min，再4 ℃孵育2 min。反轉錄利用Prime Script RT試劑盒完成。實時熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒完成。將對照組的一個樣品作為參照，其余樣品均按下列公式計算與參照的比值，各組之間對比值進行統(tǒng)計分析。公式：ΔΔ=(-)-(-)，目的mRNA的量=2。

2 結 果

2.1 不同劑量白藜蘆醇處理組結腸癌細胞凋亡結果 與對照組相比，隨著白藜蘆醇劑量的增加，結腸癌細胞HT-29、sw480和 LoVo的凋亡率顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義。在HT-29和LoVo細胞系中，低劑量處理組與對照組凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義，中、高劑量組與對照組凋亡率對比，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05，表2)。ELISA檢測結果顯示，隨著白藜蘆醇劑量的增高，結腸癌細胞HT-29、sw480和 LoVo上清液中VEGF蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05，表2)。在sw480和LoVo細胞系中，低劑量處理組與對照組VEGF表達無統(tǒng)計學意義，中、高劑量組與對照組VEGF表達差異有統(tǒng)計學意義(<0.05，表2)。

2.2 不同劑量白藜蘆醇處理組細胞凋亡關鍵分子表達變化 與對照組相比，隨著白藜蘆醇劑量的增高，結腸癌 HT-29、sw480和 LoVo細胞中Bcl-2的mRNA和蛋白含量表達明顯降低，Bax和cleaved-Caspase 3的mRNA和蛋白含量表達明顯升高，呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05，圖1，表3)。

2.3 不同劑量白藜蘆醇處理組MyD88/TLR4/NF-kB信號通路中關鍵分子表達變化 與對照組相比，中高劑量組隨著白藜蘆醇劑量的增高，結腸癌HT-29、sw480和LoVo細胞中MyD88、TLR4和NF-kB的mRNA和蛋白表達均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05，圖1，表3)。低劑量組與對照組相比差異不具有統(tǒng)計學意義，可能與處理劑量及作用時間有關。

3 討 論

白藜蘆醇，又名芪三酚，3,4’,5-三羥基芪。目前研究已證實，白藜蘆醇具有抑制腫瘤細胞血管生長、增殖、轉移和侵襲的作用，可調(diào)節(jié)細胞周期，促進腫瘤細胞的凋亡分化，并增強腫瘤細胞的放射敏感性。對肝癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌、前列腺癌等多種腫瘤有明確的抗腫瘤作用，且白藜蘆醇對正常細胞無毒性或僅具有較低毒性，有望成為新一代的抗腫瘤藥物。但其對結腸癌的具體作用和機制仍有待進一步探究。

有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白A1表達，參與 p53 信號通路激活所致的細胞凋亡和增殖阻滯作用。p53 信號通路中的 Bcl-2 和Bax蛋白間的比例決定腫瘤細胞是否接受凋亡發(fā)生的信號。Bcl-2 家族成員與細胞凋亡密切相關，通過阻止線粒體細胞色素C 的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用；Bax是 Bcl-2 家族中參與細胞凋亡的一個重要成員，當細胞受到外界刺激促發(fā)凋亡機制時，Bax從胞質遷移至線粒體和核膜，導致包括細胞色素C在內(nèi)的多種促凋亡蛋白的釋放，并激活caspases，產(chǎn)生caspases級聯(lián)反應執(zhí)行細胞凋亡；而caspase-3 是細胞凋亡過程中最關鍵的執(zhí)行分子之一，可以剪切細胞凋亡過程中的許多關鍵蛋白。白藜蘆醇能有效抑制 Bcl-2 蛋白的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，促進caspase-9和caspase-3表達，加速Hela細胞凋亡的發(fā)生。本研究通過TUNEL法檢測白藜蘆醇對于結腸癌細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制結腸癌細胞的凋亡，并呈劑量依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預后結腸癌細胞中Bcl-2的mRNA和蛋白含量表達明顯降低，Bax和cleaved-Caspase 3的mRNA和蛋白含量表達明顯升高，呈劑量依賴性。我們還進一步檢測了白藜蘆醇對于結腸癌細胞VEGF的影響，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理后結腸癌細胞上清液中VEGF蛋白表達明顯降低，提示白藜蘆醇可能還通過影響結腸癌血管生成而抑制腫瘤進展。

多項研究表明，白藜蘆醇可通過激活 p53 依賴性和非依賴性途徑、Fas依賴性途徑、Wnt/β-catenin、JAK/STAT等信號通路誘導多種腫瘤細胞凋亡。經(jīng)典的細胞信號轉導通路MyD88/TLR4/NF-κB參與激活機體內(nèi)的炎性反應、氧化應激和免疫調(diào)節(jié)等過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MyD88/TLR4/NF-kB信號通路參與多種腫瘤的多個病理生理學過程。MyD88含有TLR結構域的接頭蛋白，與Toll的結構域相互作用，進而募集白介素-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor associate kinase, IRAK),引起IRAK自身磷酸化，從而誘導腫瘤細胞釋放多種因子等一系列效應促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。國內(nèi)外研究結果顯示TLR4在結腸癌組織中高表達，與淋巴結轉移、臨床 TNM分期有關，且與腫瘤細胞增殖指數(shù)和微血管密度有關，提示TLR4可能在促進結腸癌細胞增殖和間質血管新生方面起作用，進而影響結腸癌的淋巴結轉移和臨床分期。而白藜蘆醇對于結腸癌MyD88/TLR4/NF-kB信號通路的作用有待進一步研究。本研究中利用白藜蘆醇處理結腸癌細胞后，細胞中MyD88、TLR4和NF-kB蛋白和mRNA水平均顯著下降，且呈劑量依賴性，提示白藜蘆醇能夠通過抑制MyD88/TLR4/NF-kB信號通路而參與結腸癌惡性生物學行為的調(diào)控。

綜上所述，本研究初步探討了白藜蘆醇通過抑制結腸癌MyD88/TLR4/NF-kB信號通路促進細胞凋亡的機制，為白藜蘆醇輔助治療結腸癌提供了理論依據(jù)。但本研究僅對白藜蘆醇體外的作用進行了分析研究，需要進一步研究其在體內(nèi)的作用。