尹曉丹，楊維，辛明蔚，武穎，何軍琴

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院中醫(yī)科，北京 100026)

薄型子宮內(nèi)膜通常是指卵泡發(fā)育成熟(直徑≥18 mm)時(shí)或人絨毛膜促性腺激素注射日，子宮內(nèi)膜厚度≤7 mm，其在自然妊娠及輔助生殖技術(shù)周期中較常見，與植入率和妊娠率較低相關(guān)。雖然臨床上也有子宮內(nèi)膜在4 mm和5 mm時(shí)妊娠的報(bào)道，但子宮內(nèi)膜厚度≤7 mm與妊娠率較低有關(guān)[1]。有研究表明，子宮內(nèi)膜薄可導(dǎo)致1/2～2/3的妊娠失敗[2]。目前，臨床上治療薄型子宮內(nèi)膜主要有口服、肌內(nèi)注射或局部應(yīng)用雌激素以及促性腺激素釋放激素類似物、他莫昔芬和生長激素等其他激素類治療，亦有應(yīng)用低劑量阿司匹林、西地那非等改善子宮內(nèi)膜血流等治療。從中醫(yī)學(xué)角度將薄型子宮內(nèi)膜歸類于不孕癥的治療，認(rèn)為腎虛、沖任二脈失養(yǎng)乃至不能攝精受孕；亦可由于胞宮損傷，氣滯血瘀乃至不能成孕。腎虛與血瘀之間相互影響，因此補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血活血是中醫(yī)藥對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的主要治法[3]。本研究主要探討補(bǔ)腎活血方對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stem cells，EDSCs)移植治療薄型子宮內(nèi)膜大鼠子宮內(nèi)膜CD34、整合素ανβ3及白細(xì)胞抑制因子(leukocyte inhibitor factor，LIF)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物 選用20只無特定病原體級(jí)別8周齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(200±30) g；42只8～10周齡雌性SD大鼠，體重(220±30) g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京) 2016-0004；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0004。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3 d；室溫(22±1) ℃，濕度(40±10)%，光照周期12 h/12 h。本研究通過中研子創(chuàng)(北京)生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：20190801LL)。

1.1.2藥品及試劑 補(bǔ)腎活血方組成：淫羊藿10 g、肉蓯蓉10 g、鹿角15 g、羌活6 g、細(xì)辛3 g等。煎藥濃縮后，藥物濃度為4 g/ml，置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。以上藥物由北京同仁堂有限公司加工。戊酸雌二?德國拜耳公司生產(chǎn)，規(guī)格：1 mg/片)、羥基脲(齊魯制藥有限公司生產(chǎn))、高分子右旋糖酐(瑞士Amwesham Biosciences公司生產(chǎn)，批號(hào)：Dextran70)，1%青霉素-鏈霉素(批號(hào)：15140122)、20%胎牛血清(批號(hào)：10099141)購自美國Gibco公司，CD34抗體(批號(hào)：bs-8996R)、整合素ανβ3抗體(批號(hào)：bs-1310R)、LIF抗體(批號(hào)：bs-1058R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號(hào)：PC0020)、十二烷基苯磺酸鈉(批號(hào)：S8010)購自北京索萊寶科技有限公司，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG[天德悅(北京)生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào):S004F]等。

1.1.3儀器 雙穩(wěn)態(tài)數(shù)字電泳儀(上海雙奇生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：DYY-6C)、全波長掃描多功能閱讀機(jī)(美國Termo公司生產(chǎn)，型號(hào)：6-1536)、生物組織擴(kuò)增機(jī)(武漢中天設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：KD-RS1)、自動(dòng)組織包埋機(jī)(德國萊卡生物公司生產(chǎn)，型號(hào)：ZT-MS)、ChemiScope Mini 3300化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))等。

1.2方法

1.2.1EDSCs的分離及培養(yǎng) 將20只雌性大鼠頸椎脫臼法處死，取出子宮，浸入4%的多聚甲醛固定。將子宮組織切碎，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗，然后在膠原酶Ⅲ(300 mg/L)+DNA酶(40 mg/L)中消化，在37 ℃下攪拌30～45 min。將分散的細(xì)胞溶液通過一個(gè)70目的篩子，去除腺體上皮成分。將過濾后的細(xì)胞溶液離心(1 000×g，離心5 min)，傾出上清液并重新懸浮在最低限度的必需培養(yǎng)基中，加入酚紅、1%抗生素-抗霉菌劑和20%胎牛血清。然后，將重新懸浮的細(xì)胞置于塑料瓶中，在37 ℃的濕潤環(huán)境中維持。在37 ℃的加濕房間(5%的二氧化碳)中進(jìn)行擴(kuò)增，持續(xù)1周。用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液消化上述原代細(xì)胞，并以1∶2傳代。取第3代細(xì)胞，冷凍備用。

1.2.2腎虛血瘀薄型子宮內(nèi)膜模型的建立 將42只SD大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組、模型組、戊酸雌二醇組、EDSCs+尾靜脈注射組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組，每組6只。每日早上9:00觀察陰道涂片，判斷靜止期后開始造模。除正常對(duì)照組外，其余組均造模。SD大鼠胃內(nèi)灌服羥基脲450 mg/(kg·d)，連續(xù)10 d，從第4天開始皮下注射腎上腺素0.3 mg/(kg·d)，連續(xù)7 d。大鼠出現(xiàn)拱背、不愛活動(dòng)、掉毛等，然后出現(xiàn)耳朵、爪子和尾巴發(fā)黑發(fā)紫，提示有血瘀，最終形成腎虛血瘀模型[4]；腎虛血瘀模型SD大鼠開腹找到子宮，向?qū)m腔注入95%的無水乙醇。反復(fù)輕輕抽吸，沖洗子宮腔5 min，拔出針頭，另一側(cè)子宮按上述方法操作，關(guān)閉腹部。造模36只，均造模成功。

1.2.3干預(yù)方法 正常對(duì)照組：常規(guī)灌服0.9%氯化鈉溶液；模型組：建模后常規(guī)灌服0.9%氯化鈉溶液；戊酸雌二醇組：建模后按0.3 mg/(kg·d)劑量灌服戊酸雌二醇；EDSCs+尾靜脈注射組：建模后，經(jīng)尾靜脈注射含107個(gè)EDSCs的PBS細(xì)胞懸液體1 ml；EDSCs+宮腔注射組：建模后，經(jīng)宮腔注射含107個(gè)EDSCs的PBS細(xì)胞懸液體1 ml；EDSCs+尾靜脈注射+中藥組：建模后，經(jīng)尾靜脈注射含107個(gè)EDSCs的PBS細(xì)胞懸液體1 ml，并灌服補(bǔ)腎活血方40.1 g/(kg·d)；EDSCs+宮腔注射+中藥組：建模后，經(jīng)宮腔注射含107個(gè)EDSCs的PBS細(xì)胞懸液體1 ml，并灌服補(bǔ)腎活血方40.1 g/(kg·d)；補(bǔ)腎活血方劑量參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[5]中劑量換算。連續(xù)灌胃3個(gè)動(dòng)情周期。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)子宮內(nèi)膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達(dá) 配制過氧化物酶阻斷緩沖液和抗原封閉液；在封閉液中稀釋1∶100的抗CD34、整合素ανβ3以及LIF抗體；石蠟切片常規(guī)脫蠟，將培養(yǎng)在蓋玻片上的組織用4%多聚甲醛在-20 ℃下固定5 min，然后用PBS洗凈。在4 ℃下將兔單克隆抗CD34、整合素ανβ3、LIF和兔單克隆抗phospho-CD34、ανβ3、LIF的一級(jí)抗體在蓋玻片上過夜。PBS清洗后，用生物素化的第二抗體處理蓋玻片，再次使用PBS清洗。使用氨基乙基咔唑作為底物處理組織，采用OlympusBX顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.2Western blot檢測(cè)子宮內(nèi)膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達(dá) 將組織樣品中加入預(yù)冷的無線電免疫沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)裂解液，充分研磨后離心提取組織總蛋白。使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度進(jìn)行定量。取等量蛋白樣品(30 μg/樣品)，加入變性非還原性蛋白上樣緩沖液，97 ℃加熱6 min變性，室溫冷卻離心后上樣。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，封閉液(含吐溫20的Tris緩沖液/5%脫脂奶粉)封閉30 min。加入CD34、整合素ανβ3、LIF一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。含吐溫20的Tris緩沖液洗膜后，加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室溫孵育1 h后，含吐溫20的Tris緩沖液漂洗。加入ECL化學(xué)放光試劑顯影。ChemiScope Mini 3300化學(xué)發(fā)光成像儀拍照，Quantity One軟件分析蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1EDSCs細(xì)胞形態(tài)觀察 觀察可見1 d后，少量貼壁細(xì)胞；3 d后，貼壁細(xì)胞明顯增多，多呈紡錘形；培養(yǎng)4～5 d后，貼壁細(xì)胞可見漩渦狀或放射狀生長；7～10 d后，可見細(xì)胞菌落融合成片，覆蓋在培養(yǎng)瓶底部，消化通過后細(xì)胞貼壁速度加快，見圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇第3代細(xì)胞。

圖1 光學(xué)顯微鏡下子宮內(nèi)膜干細(xì)胞形態(tài)(×100) 1a為第0代細(xì)胞培養(yǎng)第3天，1b為第3代細(xì)胞培養(yǎng)第3天

2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的各組大鼠子宮內(nèi)膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達(dá) 模型組CD34、整合素ανβ3、LIF的表達(dá)低于正常對(duì)照組(P<0.01)；戊酸雌二醇組、EDSCs+尾靜脈注射組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組的CD34、整合素ανβ3、LIF表達(dá)均高于模型組(P<0.05)；EDSCs+宮腔注射+中藥組的整合素ανβ3、LIF的表達(dá)高于EDSCs+宮腔注射組(P<0.05)，但兩組間CD34表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖2、3、4。

表1 各組SD大鼠子宮內(nèi)膜CD34、整合素ανβ3、LIF表達(dá)的比較

圖2 各組免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD34的表達(dá)(二氨基聯(lián)苯胺法染色，×100) 2a為正常對(duì)照組，2b為模型組，2c為戊酸雌二醇組，2d為子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(EDSCs)+尾靜脈注射組，2e為EDSCs+宮腔注射組，2f為EDSCs+尾靜脈注射+中藥組，2g為EDSCs+宮腔注射+中藥組

圖3 各組免疫組織化學(xué)檢測(cè)整合素ανβ3的表達(dá)(二氨基聯(lián)苯胺法染色，×100) 3a為正常對(duì)照組，3b為模型組，3c為戊酸雌二醇組，3d為子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(EDSCs)+尾靜脈注射組，3e為EDSCs+宮腔注射組，3f為EDSCs+尾靜脈注射+中藥組，3g為EDSCs+宮腔注射+中藥組

圖4 各組免疫組織化學(xué)檢測(cè)LIF的表達(dá)(二氨基聯(lián)苯胺法染色，×100) 4a為正常對(duì)照組，4b為模型組，4c為戊酸雌二醇組，4d為子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(EDSCs)+尾靜脈注射組，4e為EDSCs+宮腔注射組，4f為EDSCs+尾靜脈注射+中藥組，4g為EDSCs+宮腔注射+中藥組

2.3Western blot檢測(cè)的各組大鼠子宮內(nèi)膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達(dá) CD34表達(dá)：模型組低于正常對(duì)照組(P<0.01)；戊酸雌二醇組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+宮腔注射+中藥組高于模型組(P<0.01)，其他干預(yù)組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；EDSCs+宮腔注射組高于EDSCs+尾靜脈注射組(P<0.05)，EDSCs+尾靜脈注射+中藥組與EDSCs+尾靜脈注射組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組高于EDSCs+宮腔注射組(P<0.05)。整合素ανβ3表達(dá)：模型組低于正常對(duì)照組(P<0.01)；戊酸雌二醇組、EDSCs+尾靜脈注射組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組高于模型組(P<0.01)；EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組高于EDSCs+尾靜脈注射組(P<0.05)；EDSCs+宮腔注射+中藥組高于EDSCs+宮腔注射組(P<0.05)，EDSCs+尾靜脈注射+中藥組與EDSCs+宮腔注射組比較差無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LIF表達(dá)：模型組低于正常對(duì)照組(P<0.01)；戊酸雌二醇、EDSCs+尾靜脈注射組、EDSCs+宮腔注射組、EDSCs+尾靜脈注射+中藥組、EDSCs+宮腔注射+中藥組均高于模型組(P<0.01)，其他干預(yù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖5。

表2 各組SD大鼠子宮內(nèi)膜CD34、整合素ανβ3、LIF表達(dá)的比較

注：LIF為白細(xì)胞抑制因子，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，EDSCs為子宮內(nèi)膜干細(xì)胞

3 討 論

從第一個(gè)證明子宮內(nèi)膜內(nèi)存在成體干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)至今已有10年[6]。在這項(xiàng)研究中，子宮內(nèi)膜組織中的干細(xì)胞收集后可以在體外大量擴(kuò)增，且可用于自體或異體干細(xì)胞的移植，而不存在風(fēng)險(xiǎn)。Alawadhi等[7]報(bào)道，將EDSCs進(jìn)行宮腔移植可以治療宮腔粘連綜合征。Musina等[8]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)血中可分離并培養(yǎng)出子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，具有取材容易、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)。EDSCs在維持子宮內(nèi)膜組織動(dòng)態(tài)平衡、月經(jīng)后內(nèi)膜修復(fù)和重建中發(fā)揮重要作用[5]。EDSCs自我更新和再生可補(bǔ)充、替代因月經(jīng)期脫落、組織損傷和細(xì)胞凋亡而喪失的細(xì)胞并重建新的子宮內(nèi)膜腔，是維持正常月經(jīng)周期功能的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)[9]。

一項(xiàng)關(guān)于從7個(gè)歐洲生殖中心招募的782對(duì)夫婦的不孕研究發(fā)現(xiàn)，生育力隨年齡增長而下降[10]。其中不孕的原因有輸卵管、結(jié)核病等感染引起的盆腔炎癥、子宮方面的問題、輸卵管結(jié)扎、子宮內(nèi)膜異位癥以及高齡等[11]。子宮內(nèi)膜容受性差是不孕癥最常見的原因之一，影響胚胎植入。研究表明，中醫(yī)藥可以促進(jìn)子宮的容受性[12]。本研究采用的補(bǔ)腎活血方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科創(chuàng)始人趙松泉總結(jié)幾十年臨床經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)。全方具有補(bǔ)腎益精、活血化瘀、調(diào)經(jīng)促孕的功效。補(bǔ)腎藥物配伍養(yǎng)血活血之品更能調(diào)暢氣血，從而調(diào)節(jié)性腺功能。研究發(fā)現(xiàn)，本方通過補(bǔ)腎、養(yǎng)血、活血以調(diào)理月經(jīng)治療不孕癥[3]。

CD34是一種跨膜磷脂蛋白，最早在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[13]。在臨床上，CD34與骨髓移植造血干細(xì)胞的選擇和富集有關(guān)[14]。CD34不僅在間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)，還在許多其他非造血細(xì)胞中表達(dá)[15]，包括間充質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[16]。整合素ανβ3是最重要的細(xì)胞表面受體家族[17]。整合素ανβ3通過促進(jìn)局部血管參與內(nèi)膜的蛻膜過程而促進(jìn)胚胎植入[18-19]。LIF蛋白在多種組織中表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性[20]。因此，本研究通過檢測(cè)上述指標(biāo)來評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)及Western blot法對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD34進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示各干預(yù)組CD34表達(dá)均不同程度的增加，其原因可能是在建立腎虛血瘀薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型后，產(chǎn)生了無菌性的子宮內(nèi)膜損傷，在采用尾靜脈、宮腔注射EDSCs及灌服補(bǔ)腎活血方治療后可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增生[21]。本研究進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)整合素ανβ3、LIF，結(jié)果顯示各干預(yù)組大鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3、LIF的表達(dá)均增加，加用中藥后效果更佳，提示移植EDSCs不僅可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生，還可以改善子宮內(nèi)膜容受性。有研究發(fā)現(xiàn)，以小鼠EDSCs移植治療能夠修復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜[22]。亦有研究采用自體EDSCs移植治療重度宮腔粘連，可以重建和修復(fù)子宮內(nèi)膜[23]。

綜上所述，補(bǔ)腎活血方可以增加EDSCs移植治療薄型子宮內(nèi)膜大鼠子宮內(nèi)膜CD34、整合素ανβ3、LIF的表達(dá)，從而起到改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。內(nèi)皮細(xì)胞的增生與子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志蛋白的表達(dá)并非呈線性關(guān)系。這種情況一方面可能由于存在實(shí)驗(yàn)誤差，另一方面也提示應(yīng)進(jìn)一步探討評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)。