夏 天 ，崔 迎 ，任文鑫 ，楊曉莉 ，毋堃杰 ，李宏鐸 △

（1. 陜西省西安市食品藥品檢驗(yàn)所·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710054； 2. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065）

水分活度由澳大利亞科學(xué)家Scott 于1953 年提出，是指產(chǎn)品水蒸氣壓與同溫度下純水蒸氣壓的比值［1-2］。其在本質(zhì)上可理解為結(jié)合水含量越高，水分活度越低［2］，可用于微生物生長(zhǎng)繁殖的水越少［3-4］。作為微生物可利用水量度的重要參數(shù)，水分活度也是影響微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素［5］，在食品和化妝品的微生物控制方面已有應(yīng)用［6-7］。2006 年，《美國(guó)藥典》1112 章節(jié)中已發(fā)布水分活度測(cè)定在非無(wú)菌制劑中的應(yīng)用指導(dǎo)原則［8］。本研究中參考該指導(dǎo)原則中產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)所需的最低水分活度（0.95）及文獻(xiàn)［9 - 12］，分別以氯化鈉、葡萄糖和甘油作為水分活度調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的水分活度值在 0.90～0.99 范圍內(nèi)［2，13］，測(cè)定產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)所需的最低水分活度，以為《中國(guó)藥典》相關(guān)內(nèi)容的增訂提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與菌種

儀器：Aqualab 4TE 型水分活度儀（美國(guó)Meter Group Inc.）；THERMO1378 型生物安全柜（賽默飛世爾科技有限公司）；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SX - 500 型高壓蒸汽滅菌器（日本Tomy公司）；SQP 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為10 mg）。

試劑：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM，北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)為170808）；胰胨- 亞硫酸鹽- 環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC，北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)為171108；氯化鈉（批號(hào)為20180509），丙三醇（批號(hào)為20180223），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20180110）。

菌種：產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，廣東環(huán)凱生物科技有限公司，編號(hào)為ATCC 13124，工作用菌株為第3代）。

1.2 方法

不同水分活度培養(yǎng)基的配制：分別以氯化鈉、葡萄糖及甘油作為水分活度調(diào)節(jié)劑，并測(cè)定其滅菌后的水分活度值，制備不同水分活度的FTM。以3 種水分活度調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量對(duì)培養(yǎng)基水分活度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液的制備：將產(chǎn)氣莢膜梭菌轉(zhuǎn)接至FTM中，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)苽涑刹煌瑵舛鹊木鷳乙骸?/p>

定性試驗(yàn)：按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，配制水分活度在0.90～0.99 范圍內(nèi)梯度為0.01 的系列FTM；同時(shí)配制不調(diào)節(jié)水分活度的FTM，作為對(duì)照組（T0）。取產(chǎn)氣莢膜梭菌菌懸液，分別加入上述FTM 中，每管裝量20 mL，使菌液濃度達(dá)到102cfu/mL。各組培養(yǎng)物置（36±1）℃溫度條件下厭氧培養(yǎng)30 d，逐日觀(guān)察生長(zhǎng)情況，目測(cè)判斷，渾濁表明有生長(zhǎng)，澄清表明未生長(zhǎng)。

定量試驗(yàn)：通過(guò)定性試驗(yàn)，初步獲得產(chǎn)氣莢膜梭菌在不同介質(zhì)的FTM 中生長(zhǎng)所需最低水分活度，選擇最低水分活度附近3 個(gè)水平，即低于水分活度限值0.01（T1）、水分活度限值（T2）和高于水分活度限值0.01（T3），同時(shí)配制不調(diào)節(jié)水分活度的FTM，裝量均為100 mL，接種產(chǎn)氣莢膜梭菌菌懸液，使菌液濃度達(dá)到102cfu/mL。于（36 ± 1）℃溫度條件下培養(yǎng)，分別于0，2，16，18，20，24，42，48，72，90，120，144 h時(shí)以TSC 培養(yǎng)計(jì)數(shù)。以測(cè)得平均菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值（logcfu）對(duì)時(shí)間（t，h）作圖，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同介質(zhì)調(diào)節(jié)FTM 水分活度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

由圖1 可知，隨著氯化鈉、葡萄糖和甘油質(zhì)量的增加，水分活度呈下降趨勢(shì)。相同水分活度時(shí)，3 種水分活度調(diào)節(jié)劑質(zhì)量差異較大。當(dāng)水分活度為0.98時(shí)，每100 mL FTM 中分別需要添加氯化鈉3.51 g、葡萄糖13.80 g、甘油9.08 g。

圖1 FTM中3種水分活度調(diào)節(jié)劑質(zhì)量-水分活度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)A.NaCl B.Glucose C.GlycerolFig.1 Standard curves of quality - water activity of three water activity regulators in FTM

2.2 定性試驗(yàn)結(jié)果

以氯化鈉、葡萄糖和甘油為水分活度調(diào)節(jié)劑的FTM 中，產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低生長(zhǎng)水分活度分別為0.98，0.98，0.95。這與《美國(guó)藥典》中產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)所需最低水分活度（0.95）［8］一致。

2.3 定量試驗(yàn)結(jié)果

產(chǎn)氣莢膜梭菌在3 種不同水分活度調(diào)節(jié)劑中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。從生長(zhǎng)曲線(xiàn)來(lái)看，以氯化鈉和葡萄糖調(diào)節(jié)FTM 水分活度時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)所需最低水分活度均為0.98；以甘油作調(diào)節(jié)劑時(shí)為0.95，與定性試驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)定性試驗(yàn)結(jié)果，以氯化鈉和葡萄糖調(diào)節(jié)水分活度時(shí)，T1，T2，T3應(yīng)分別為0.97，0.98，0.99，但T3與對(duì)照組水分活度相同。為保證試驗(yàn)完整性，并探討產(chǎn)氣莢膜梭菌在水分活度限值以下的生長(zhǎng)情況，本研究中將氯化鈉和葡萄糖介質(zhì)中T1，T2，T3調(diào)整為0.96，0.97，0.98。

圖2 不同介質(zhì)FTM中產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)A.NaCl B.Glucose C.GlycerolFig.2 Growth curves of Clostridium perfringens in FTM with different media

由圖2 可知，水分活度會(huì)影響產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)。產(chǎn)氣莢膜梭菌在水分活度較高時(shí)生長(zhǎng)較旺盛，在水分活度較低時(shí)生長(zhǎng)緩慢，低于一定值時(shí)則停止生長(zhǎng)甚至死亡。由圖2 A和圖2 B可知，產(chǎn)氣莢膜梭菌在水分活度大于0.98時(shí)生長(zhǎng)較快，低于0.98時(shí)不生長(zhǎng)，且3次試驗(yàn)結(jié)果一致，重復(fù)性良好，表明以氯化鈉和葡萄糖調(diào)節(jié)水分活度，產(chǎn)氣莢膜梭菌最低生長(zhǎng)水分活度為0.98。由圖2 C可知，當(dāng)水分活度為0.96時(shí)，生長(zhǎng)較快，生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組相似；當(dāng)水分活度為0.95 時(shí)，雖有生長(zhǎng)現(xiàn)象，但其生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯弱于0.96，表明以甘油調(diào)節(jié)水分活度，產(chǎn)氣莢膜梭菌最低生長(zhǎng)水分活度為0.95。

由圖2可知，水分活度與產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌液濃度呈正相關(guān)，產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù)隨水分活度的降低而減少。同時(shí)，水分活度為0.98 時(shí)，氯化鈉的菌液濃度對(duì)數(shù)值略低于對(duì)照組，葡萄糖的低于氯化鈉；甘油在水分活度為0.95 時(shí)的菌液濃度對(duì)數(shù)值顯著低于對(duì)照組，第2次試驗(yàn)中表現(xiàn)尤為明顯。不同介質(zhì)調(diào)節(jié)水分活度會(huì)影響產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)遲緩期的長(zhǎng)短。由圖2 A 可知，水分活度為0.98時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌的遲緩期為0～20 h。由圖2 B 可知，水分活度為0.98 時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌的遲緩期為0～40 h，且其生長(zhǎng)先短暫停滯，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)生長(zhǎng)繁殖逐漸恢復(fù)。由圖2 C 可知，當(dāng)水分活度高于0.95 時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)較快，16 h 即開(kāi)始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；當(dāng)水分活度為0.95時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌44 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，遲緩期時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。表明產(chǎn)氣莢膜梭菌出現(xiàn)臨界生長(zhǎng)狀態(tài)，與產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)所需最低水分活度（0.95）的結(jié)果一致。

3 討論

在厭氧培養(yǎng)條件下，以氯化鈉和葡萄糖為水分活度調(diào)節(jié)劑，當(dāng)水分活度低于0.98時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌停止生長(zhǎng)；以甘油為水分活度調(diào)節(jié)劑，當(dāng)水分活度低于0.95時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌停止生長(zhǎng)。其中，產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)甘油最耐受。相同菌液接種量下，甘油的0 h 菌落數(shù)對(duì)數(shù)值高于葡萄糖，氯化鈉最低。這可能是因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭陽(yáng)性厭氧菌［14］，甘油可作為厭氧菌的一種保存助劑［15］，可在一定程度上促進(jìn)其生長(zhǎng)。

大多數(shù)微生物的代謝活動(dòng)需要水分子參與，水分活度降低會(huì)導(dǎo)致微生物的代謝活性降低［16］。本研究結(jié)果表明，隨著水分活度的降低，產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)活性逐漸受到抑制。由生長(zhǎng)曲線(xiàn)可知，產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液濃度的降低，停滯時(shí)間的延長(zhǎng)，都與水分活度降低呈正相關(guān)。水分活度與微生物的生長(zhǎng)密切相關(guān)，是判斷微生物風(fēng)險(xiǎn)與控制產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，但目前微生物污染控制方面的應(yīng)用和研究仍屬罕見(jiàn)［17-18］。故有必要深入研究水分活度在非無(wú)菌藥品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，以縮短藥品放行周期，降低庫(kù)存成本和檢測(cè)成本。