張 倩，任丹丹，張?zhí)煺?，?燕，王 浩，包建平,2,3

（1 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300）（2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）（3 南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室）

庫爾勒香梨原產(chǎn)于新疆南部，具有香味濃郁、肉質(zhì)細(xì)膩、清脆爽口和耐貯藏等特點(diǎn)，是新疆“名、特、優(yōu)”水果之一[1]。由于遺傳特性，庫爾勒香梨有脫萼果與宿萼果之分，其中脫萼果營(yíng)養(yǎng)豐富、肉 質(zhì)鮮嫩，外觀品質(zhì)明顯優(yōu)于宿萼果[2]，且石細(xì)胞含量明顯低于宿萼果。

梨果實(shí)品質(zhì)主要由石細(xì)胞團(tuán)所影響，果實(shí)中的石細(xì)胞團(tuán)直徑越大，果肉就越粗糙，口感多渣，含糖量降低，甚至果肉變硬[3-4]。木質(zhì)素是石細(xì)胞的主要成分，梨果實(shí)中的石細(xì)胞與木質(zhì)素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及沉積密切相關(guān)[5]。木質(zhì)素生物合成通過苯丙烷類代謝途徑進(jìn)行，其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）是該代謝第一個(gè)關(guān)鍵酶，其他如過氧化物酶（POD）與多酚氧化酶（PPO）參與了木質(zhì)素單體合成的后續(xù)過程[6-8]，因此PAL、POD、PPO 等是木質(zhì)素合成過程中的關(guān)鍵性酶，其酶活性的高低與木質(zhì)素合成密切相關(guān)[9-12]。在木質(zhì)素的組分及其合成積累規(guī)律的基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)了梨果實(shí)中相關(guān)合成酶活性與木質(zhì)素含量之間存在顯著相關(guān)關(guān)系[13-15]，同時(shí)有研究表明，通過噴施外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成，適當(dāng)?shù)貒娛┮阴Ｄ憠A可抑制POD、PPO、PAL 的活性，可以減小石細(xì)胞團(tuán)的直徑，降低石細(xì)胞密度和含量[16]。汪曉謙等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PBO＋鈣硼合劑的處理不僅能有效提高果實(shí)脫萼率，顯著增加可溶性固形物含量，同時(shí)可使石細(xì)胞含量減少12.2%。目前生產(chǎn)實(shí)踐中存在大量使用脫萼劑的情況，但對(duì)果實(shí)石細(xì)胞、木質(zhì)素及其關(guān)鍵合成酶的研究較少，因此本試驗(yàn)以庫爾勒香梨為試驗(yàn)材料，研究對(duì)比庫爾勒香梨果實(shí)的石細(xì)胞含量、木質(zhì)素含量及其相關(guān)酶活性的變化，從而為生產(chǎn)中減少庫爾勒香梨果實(shí)石細(xì)胞含量、提高果肉細(xì)膩程度奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在塔里木大學(xué)行政樓西側(cè)梨園進(jìn)行，供試材料為13 年生的庫爾勒香梨，梨園常規(guī)管理。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

試驗(yàn)于2020 年進(jìn)行，于庫爾勒香梨大蕾期，分別噴施脫萼劑（國(guó)光生產(chǎn)）500 倍液、100 mg/L三碘苯甲酸（TIBA）溶液，以噴清水為對(duì)照，樹體全覆蓋噴施，每個(gè)處理5 株樹。分別在庫爾勒香梨盛花后15、36、81、110、145 d（果實(shí)成熟期）采集脫萼果，每處理采集100 個(gè)果，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。除部分新鮮果實(shí)直接用于染色外，其余果實(shí)用于石細(xì)胞、木質(zhì)素含量及其關(guān)鍵合成酶活性測(cè)定。

1.2.1 果實(shí)脫萼率調(diào)查

盛花后20 d，各處理分別隨機(jī)選取100 個(gè)果實(shí)統(tǒng)計(jì)其脫萼率。

1.2.2 石細(xì)胞在梨果實(shí)中的分布情況

分別選取不同處理的庫爾勒香梨各20 個(gè)，果肉表面滴濃鹽酸，隨后將5%間苯三酚滴在果實(shí)縱切面，使其與木質(zhì)素在酸性環(huán)境下發(fā)生櫻紅色反應(yīng)，染色1～2 min，分析石細(xì)胞在梨果實(shí)中分布情況。

1.2.3 果實(shí)石細(xì)胞含量的測(cè)定及分級(jí)

隨機(jī)選取各處理的庫爾勒香梨果實(shí)各20 個(gè)，放入冰箱冷凍24 h，取果肉20 g，用冷凍分離法[15]和鹽酸處理法[18]結(jié)合將石細(xì)胞分離，分離后的石細(xì)胞烘干，采用重量法測(cè)定果肉中石細(xì)胞含量，重復(fù)3 次，并取平均值。根據(jù)《梨種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》利用不同直徑（150、200、250、300、500μm）的試驗(yàn)篩網(wǎng)對(duì)石細(xì)胞過濾分級(jí)。

1.2.4 果實(shí)木質(zhì)素含量的測(cè)定

參照劉盼盼[13]的方法進(jìn)行木質(zhì)素含量的測(cè)定。將20 g 石細(xì)胞樣品干燥并用無水乙醇研磨至粉末狀，抽提3 次，冷凍干燥。取干粉樣品，加入15 mL 72%H2SO4，在30 ℃水浴中抽提1 h，沸水浴1.2 h，并加入120 mL 蒸餾水。反應(yīng)后的混合液用300 mL煮沸的蒸餾水沖洗過濾，將過濾后得到的木質(zhì)素烘干稱重，得出石細(xì)胞中木質(zhì)素所占百分比。

1.2.5 果實(shí)木質(zhì)素相關(guān)關(guān)鍵合成酶活性的測(cè)定

參照曹建康等[19]的方法，稱取0.1 g 液氮下研磨完成的果皮樣品，分別加入1 mL PAL、PPO、POD的對(duì)應(yīng)提取液，于4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清液為粗酶提取液，4 ℃保存。

（1）PAL 活性的測(cè)定。試管中加入5.5 mL 反應(yīng)體系，包括酶提取液0.4 mL、苯丙氨酸（終濃度1 mmol/L）1 mL、硼酸鈉緩沖液4.1 mL，同時(shí)設(shè)2個(gè)空白對(duì)照，試管于37 ℃水浴1 h 后，加入35%三氟乙酸0.5 mL 終止反應(yīng)，并離心除去變性蛋白，測(cè)定290 nm 波長(zhǎng)處反應(yīng)液的吸光值，以每小時(shí)吸光值變化0.01 為1 個(gè)活性單位（U）。

（2）POD 活性的測(cè)定。采用愈創(chuàng)木酚作為底物的連續(xù)測(cè)定方法。玻璃比色皿中反應(yīng)體系包括0.2%愈創(chuàng)木酚、0.125%過氧化氫、磷酸鈉緩沖液以及100 μL 酶提取液，于470 nm 波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定反應(yīng)液吸光值3 min，以每分鐘吸光值變化0.01 為1個(gè)活性單位（U）。

（3）PPO 活性的測(cè)定。反應(yīng)液總體積為3 mL，包括鄰苯二酚1 mL、酶提取液0.1 mL 和磷酸緩沖液1.9 mL，測(cè)定反應(yīng)液在398 nm 波長(zhǎng)下的吸光值，酶活性以每分鐘吸光值變化0.01 為1 個(gè)活性單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010 對(duì)試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與作圖，使用DPS 9.05 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)脫萼率分析

如圖1 所示，脫萼劑處理的脫萼率最高，為86%，明顯高于TIBA 處理和對(duì)照，說明脫萼劑可使庫爾勒香梨果實(shí)的脫萼率增加，從而影響其口感和品質(zhì)。

圖1 不同處理果實(shí)脫萼率

2.2 果實(shí)發(fā)育過程中石細(xì)胞的分布情況

從庫爾勒香梨不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)石細(xì)胞分布來看（圖版2），染色范圍最大的時(shí)期均為盛花后36 d 與81 d，果實(shí)果梗處被深度染色，盛花后110 d與145 d 的染色范圍較小，顏色較淺。此外，果梗與果萼處呈現(xiàn)兩端石細(xì)胞多中間少的現(xiàn)象，越 靠近胴部可被染色的石細(xì)胞數(shù)目越少。在盛花36 d后，可被染色的石細(xì)胞逐漸減少，總體石細(xì)胞數(shù)量趨勢(shì)是先增加后下降。

2.3 果實(shí)發(fā)育過程中石細(xì)胞重量與分級(jí)

如圖2 所示，從整體上看出，庫爾勒香梨果肉中石細(xì)胞重量在盛花后15～36 d 呈增加趨勢(shì)；在盛花后36 d 達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)，且脫萼劑處理的石細(xì)胞重量明顯高于對(duì)照。脫萼劑處理后，在盛花后15 d 粒徑大于0.3 mm 的石細(xì)胞所占比率為0.52%，在盛花后110 d 粒徑大于0.3 mm 的石細(xì)胞所占比率為0.48%，說明盛花后期石細(xì)胞團(tuán)趨于變小。

圖2 不同發(fā)育時(shí)期不同處理果實(shí)石細(xì)胞重量與分級(jí)

2.4 果實(shí)發(fā)育過程中石細(xì)胞含量變化

如圖3 所示，庫爾勒香梨果實(shí)石細(xì)胞含量隨果實(shí)的發(fā)育而變化。不同處理間總體趨勢(shì)大致相同，在果實(shí)生長(zhǎng)初期石細(xì)胞含量逐漸增加，在盛花后15 d 開始上升，至盛花后36 d 達(dá)到最大值，但從盛花后36 d 開始，石細(xì)胞含量逐漸下降，在盛花后145 d 降至最低。TIBA 處理的石細(xì)胞含量始終最高，在盛花后110 d脫萼劑與TIBA處理的石細(xì)胞含量均高于對(duì)照，且在果實(shí)成熟期即盛花后145 d 顯著高于對(duì)照。

圖3 不同發(fā)育時(shí)期不同處理果實(shí)中石細(xì)胞含量

2.5 果實(shí)發(fā)育過程中木質(zhì)素含量變化

由圖4 可以看出，庫爾勒香梨果實(shí)木質(zhì)素含量隨著果實(shí)的發(fā)育而升高。木質(zhì)素含量在盛花后36 d急劇増加，脫萼劑、TIBA 處理和對(duì)照的木質(zhì)素含量分別達(dá)9.38%、10.20%、8.20%，這可能是果實(shí)發(fā)育的主要時(shí)期。在果實(shí)發(fā)育過程中，脫萼劑、TIBA處理的木質(zhì)素含量始終高于對(duì)照，其中TIBA 處理與對(duì)照差異均達(dá)顯著水平。

圖4 不同發(fā)育時(shí)期不同處理果實(shí)木質(zhì)素含量

2.6 果實(shí)發(fā)育過程中木質(zhì)素代謝相關(guān)酶活性變化

2.6.1 PAL 活性的變化

如圖5 所示，庫爾勒香梨生長(zhǎng)發(fā)育過程中，各處理果實(shí)PAL 的活性變化趨勢(shì)是大致相同的，均在盛花后15～36 d 呈增加趨勢(shì)，在盛花后36 d 達(dá)到最大值，之后呈逐漸下降的趨勢(shì)，盛花后145 d 降至最低。不同處理間的PAL 活性存在一定差異，TIBA 處理的PAL 活性始終高于對(duì)照，脫萼劑處理與對(duì)照差異不顯著。

圖5 不同發(fā)育時(shí)期不同處理果實(shí)PAL 活性的變化

2.6.2 POD 活性的變化

在庫爾勒香梨果實(shí)的整個(gè)發(fā)育時(shí)期，POD 活性在盛花后15～36 d 呈增加趨勢(shì)，盛花后36 d 達(dá)到最大值，之后呈逐漸下降的趨勢(shì)（圖6）。不同處理間的果實(shí)POD 活性有一定差異，TIBA 處理的果實(shí)POD 活性均顯著高于其他2 個(gè)處理，脫萼劑處理的POD 活性與對(duì)照差異不顯著。

圖6 不同發(fā)育時(shí)期不同處理果實(shí)POD 活性的變化

2.6.3 PPO 活性的變化

如圖7 所示，在果實(shí)發(fā)育過程中，不同處理的PPO 活性總體變化趨勢(shì)相似，均在盛花后呈先增加后下降的趨勢(shì)。不同處理間的果實(shí)PPO 活性存在一定差異，TIBA 處理的果實(shí)PPO 活性始終高于其他2 個(gè)處理，脫萼劑處理的PPO 活性與對(duì)照差異不顯著。

圖7 不同發(fā)育時(shí)期不同處理果實(shí)PPO 活性的變化

3 討 論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是一種能夠有效控制植物生長(zhǎng)發(fā)育的人工合成的化學(xué)成分，噴施不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)果樹的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、改善果實(shí)部分品質(zhì)。前人研究發(fā)現(xiàn)，庫爾勒香梨坐果率、脫萼率會(huì)因不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑產(chǎn)生不同的影響[20-21]。同樣本研究發(fā)現(xiàn)，脫萼劑和TIBA 可以提高庫爾勒香梨的脫萼率，且脫萼劑的脫萼效果更佳。

石細(xì)胞是一種厚壁組織細(xì)胞，由薄壁組織細(xì)胞將木質(zhì)素沉積在厚壁組織細(xì)胞的初生壁上而形成的[22]。劉玲等[4]研究表明，庫爾勒香梨果實(shí)從花后15 d 逐漸開始形成石細(xì)胞，花后50 d 左右達(dá)到最大值，之后隨著果實(shí)成熟石細(xì)胞團(tuán)的密度表現(xiàn)下降的趨勢(shì)。本研究表明，盛花后15～36 d 石細(xì)胞含量不斷增加達(dá)到高峰，盛花36 d 后石細(xì)胞含量逐漸減少，這與前人研究結(jié)果一致。梨果實(shí)發(fā)育過程中木質(zhì)素含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，且石細(xì)胞含量與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)[23-24]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在盛花后15～36 d 木質(zhì)素含量不斷增加達(dá)到高峰，盛花36 d 后木質(zhì)素含量表現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且木質(zhì)素含量與石細(xì)胞含量發(fā)育趨勢(shì)存在一致性。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果表明在盛花后36～81 d 脫萼劑處理的庫爾勒香梨石細(xì)胞含量與對(duì)照相比有所下降，但在盛花后110 d脫萼劑與TIBA處理的果實(shí)石細(xì)胞含量均高于對(duì)照，且TIBA 處理顯著高于對(duì)照，同時(shí)盛花后145 d 均顯著高于對(duì)照。

庫爾勒香梨果實(shí)石細(xì)胞是一種高度分化的木質(zhì)化的細(xì)胞，梨果實(shí)石細(xì)胞主要由木質(zhì)素和纖維素組成。章霄云等[25]研究表明，PAL、POD、PPO 在木質(zhì)素的合成過程中發(fā)揮有重要的調(diào)控作用。王丹陽[26]研究發(fā)現(xiàn)，隨著梨果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育POD 活性有一個(gè)上升趨勢(shì)，并達(dá)到一個(gè)酶活最大值，再逐漸下降。這與本研究結(jié)果基本一致，在盛花后15～36 d果實(shí)POD 活性不斷增加達(dá)到高峰，盛花36 d 后呈下降的趨勢(shì)。張紹鈴等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)發(fā)育初期PPO 的活性較高，隨著果實(shí)發(fā)育逐漸降低；PAL與PPO 活性變化相似。這與本研究結(jié)果一致，PPO與PAL 活性變化均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。陶書田等[28]研究表明，梨果實(shí)中POD、PAL 及PPO 活性與果實(shí)中石細(xì)胞的形成之間呈正相關(guān)。張士鴻[29]研究發(fā)現(xiàn)，碭山酥梨果實(shí)石細(xì)胞含量、木質(zhì)素含量及木質(zhì)素相關(guān)酶活性的變化趨勢(shì)基本相同，總體上均呈先升高后下降的趨勢(shì)，三者之間均呈顯著正相關(guān)，且在時(shí)間上表現(xiàn)出一定的時(shí)序性。這與本研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，石細(xì)胞含量、木質(zhì)素含量、木質(zhì)素代謝過程中相關(guān)酶活性之間存在時(shí)序性、一致性，且趨勢(shì)均為先升高后下降。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究表明脫萼劑和TIBA 均可以使庫爾勒香梨果實(shí)脫萼率增加，且脫萼劑處理效果更佳。同時(shí)果實(shí)發(fā)育前期，經(jīng)過脫萼劑與TIBA 處理的庫爾勒香梨果實(shí)中木質(zhì)素相關(guān)酶PAL、POD、PPO 的活性升高，從而造成石細(xì)胞含量與對(duì)照相比有所增加；盛花期后110 d，脫萼劑與TIBA 處理的石細(xì)胞含量均高于對(duì)照，且在果實(shí)成熟期即盛花后145 d 均顯著高于對(duì)照，但TIBA 處理的石細(xì)胞含量始終高于脫萼劑處理。綜上，建議在實(shí)際生產(chǎn)中采用脫萼劑處理，在提高脫萼率的同時(shí)，更有利于保證庫爾勒香梨的果實(shí)品質(zhì)。